Polymerázová řetězová reakce aneb Děkujeme, pane Mullis!

1. www.zivaveda.ivb.cz CZ.1.07/2.3.00/35.0026Věda všemi smysly Polymerázová řetězová reakceanebDěkujeme, pane Mullis! Vytvořila: Mgr. Tereza Králová

2. DNA - nositelka dědičné informace • deoxyribonukleová kyselina • objev struktury v roce 1953(J. Watson, F. Crick, M. Wilkins) • buňka → jádro → chromozom → histon → vlákno DNA → gen • nukleotidy: adenin (A), guanin (G), thymin (T), cytosin (C) cs.wikipedia.org/wiki/Párování_bází princip komplementarity tokresource.org

3. Proces přenosu genetické informace translace RNA → protein replikace DNA → DNA transkripce DNA → RNA nové vlákno nové vlákno původní vlákno DNA původní vlákno DNA replikace DNA http://www.mojechemie.cz/Biochemie:Nukleov%C3%A9_kyseliny

4. Genetický kód

5. Klonování vložení DNA do bakteriálního vektoru Cizorodá DNA misky s agarem (= živnou půdou) zájmová oblast Escherichia coli Spojení plasmidu a naší DNA bílé tečky = narostlé kolonie bakteriálních klonů Vložení DNA do bakterie http://www.disputeabout.eu/clanek/what-the-heck-is-an-e-coli Klony http://biologie-v-kostce.blogspot.cz/2011/05/66-metody-prenosu-dna-do-eukaryontnich.html

6. Dr. Kary B. Mullis (* 28. 12. 1944) Až jednoho dne… americkýbiochemik Cetus Corporation, Kalifornie 1983objevpolymerázovéřetězovéreakce $10,000 bonus (Cetus - $300 milionů od firmy Roche Molecular Systems) 1993 Nobelovacenazachemii

7. Polymerázová řeťezová reakce = PCR, z angl. PolymeraseChainReaction ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii Thermusaquaticus „polymerázová“ – využití DNA polymerázy (replikace) „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci DNA polymeráza v přírodě existuje mnoho typů schopnost zkopírovat DNA (za optimálních podmínek a přítomnosti určitých látek) Taqpolymeráza (izolována 1965) Národní park Yellowstone optimum 72°C Thomas D. Brock http://www.yellowstonepark.com/scenic-drive-hot-springs-geysers/ http://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase

8. G Složky PCR DNA (templát) C A G C T A oligonukleotidy (tzv. primery) volné dinukleotidy (dNTPs) C A G pufr T DNA polymeráza hořčík (Mg2+) Taq ddH2O a další…

9. 1. Denaturace (Denaturing) 94°C

10. 2. Nasedání primerů (Annealing) 50-65°C

11. 3. Elongace - prodlužování vlákna (Extension) 72°C

12. 3. Elongace - prodlužování vlákna (Extension) 72°C

13. 3. Elongace – prodlužování vlákna (Extension) 72°C

14. Opakování cyklu exponenciální amplifikace zdvojnásobení počtu molekul po každém cyklu 32 cyklů = 4 294 967 296 kopií po x-témcyklu => 2xmolekul DNA http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

15. Automatizace mikrozkumavky na PCR „Baby Blue“ (1986) starší prototyp termocykleru Techne TC-PLUS (2010) Biometra T1 (1999)  G-STORM GS4 (2006) EppendorfMastercycler EP (2003) http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

16. Využití v praxi lékařství molekulární biologie genetika biochemie testy otcovství forenzní vědy kriminalistika paleobiologie a další… www.rkm.com.au http://humanresrourcelegalresource.wordpress.com/2012/01/ http://www.scq.ubc.ca/a-brief-tour-of-dna-fingerprinting/ http://www.environmentalgraffiti.com http://musicoronada.blogspot.cz/2012/03/1b-y-1c-el-mamut.html

17. Lékařství detekcemutací - diagnózaleukémie (SPRED1 gen), lymfomů detekcenákazy – HIV, tuberkulóza(Mycobacterium tuberculosis), ... preimplantačnídiagnóza (uměléoplodnění) prenatálnídiagnostika (amniocentéza – Rh faktor, Downůvsyndromapod.) “PCR made it easier to see that certain people are infected with HIV.” Kary Mullis

18. Genetika a molekulární biologie Genetické inženýrství základní výzkum (identifikace druhů, taxonomické vztahy…) testy paternity (polygamie, mimopárová paternita…) geneticky modifikované organismy (GMO) genováterapie – pomocívirů (léčbadědičnýchonemocnění, nahrazenínefunkčního genu funkčním) Paleobiologie „ancient DNA“ www.plosone.org

19. Kriminalistika genetický otisk prstu (DNA fingerprint) genetická daktyloskopie spolehlivá identifikace jedince (člověk – použití 13 mikrosatelitů) pachatel podezřelý 1 podezřelý 2 podezřelý 3

20. Nevýhody využití metody citlivost - nutnost optimalizace heterozygotní sekvence náročnénakoncentraci DNA (animoc, animálo) chybyDNA polymerázy (tzv. PCR artefakty) … atd. Výhody však jednoznačně převažují, takže… Díky, pane Mullis!

21. Užitečné odkazy: Osobní stránky K. Mullise, obsahují popis objevu a principu PCR (vč. videa) http://www.karymullis.com/pcr.shtml Popis událostí předcházejících objevu PCR http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_polymerase_chain_reaction Video o průběhu PCR http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU Modifikace PCR http://en.wikipedia.org/wiki/Variants_of_PCR PCR song, povedená píseň firmy BioRad http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads PCR song, text http://biorad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioRad_PCRsong_Lyrics.pdf

22. Kvíz 1. Z čeho je odvozena zkratka PCR? A) Progressive Chain Reaction B) Polymerase Chain Reaction C) Polymerase Cumulative Reaction

23. Kvíz 1. Z čeho je odvozena zkratka PCR? A) ProgressiveChainReaction B) PolymeraseChainReaction C) PolymeraseCumulativeReaction

24. Kvíz 2. Kdo v roce 1983 objevil metodu PCR? A) James Watson a Francis Crick B) Maurice Wilkins C) Kary B. Mullis

25. Kvíz 2. Kdo v roce 1983 objevil metodu PCR? A) James Watson a Francis Crick B) Maurice Wilkins C) Kary B. Mullis

26. Kvíz 3. Princip komplementarity je pravidlo, podle kterého se vzájemně párují nukleotidové báze dvou řetězců DNA. Jak? adenin s guaninem, thymin s cytosinem adenin s thyminem, guanin s cytosinem adenin s cytosinem, guanin s thyminem

27. Kvíz 3. Princip komplementarity je pravidlo, podle kterého se vzájemně párují nukleotidové báze dvou řetězců DNA. Jak? A) adenin s guaninem, thymin s cytosinem B) adenin s thyminem, guanin s cytosinem C) adenin s cytosinem, guanin s thyminem

28. Kvíz 4. Která složka polymerázové řetězové reakce je přímo zodpovědná za navazování volných dinukleotidů na templátovou DNA a tím prodlužování vlákna? A) DNA polymeráza B) pufr s rozpuštěnými kationty Mg2+ C) krátké oligonukleotidy (primery)

29. Kvíz 4. Která složka polymerázové řetězové reakce je přímo zodpovědná za navazování volných dinukleotidů na templátovou DNA a tím prodlužování vlákna? A) DNA polymeráza B) pufr s rozpuštěnými kationty Mg2+ C) krátké oligonukleotidy (primery)

30. Kvíz 5. Při jaké teplotě dochází k denaturaci vlákna DNA, čili přerušení vodíkových vazeb mezi nukleotidovými bázemi a rozdělení dvoušroubovice na dvě samostatná vlákna? A) 72°C B) 87°C C) 94°C

31. Kvíz 5. Při jaké teplotě dochází k denaturaci vlákna DNA, čili přerušení vodíkových vazeb mezi nukleotidovými bázemi a rozdělení dvoušroubovice na dvě samostatná vlákna? A) 72°C B) 87°C C) 94°C

32. Kvíz 6. Jak se nazývají tři základní kroky jednoho cyklu polymerázové řetězové reakce? A) polymerace, methylace, oxidace B) replikace, transkripce, translace C) denaturace, nasedání primerů, elongace

33. Kvíz 6. Jak se nazývají tři základní kroky jednoho cyklu polymerázové řetězové reakce? A) polymerace, methylace, oxidace B) replikace, transkripce, translace C) denaturace, nasedání primerů, elongace

34. Kvíz 7. Jak roste počet kopií DNA po každém cyklu PCR? A) exponenciálně B) lineárně C) logaritmicky

35. Kvíz 7. Jak roste počet kopií DNA po každém cyklu PCR? A) exponenciálně B) lineárně C) logaritmicky

36. Kvíz 8. Který přirozený proces přenosu genetické informace napodobuje metoda PCR? A) translaci B) transkripci C) replikaci

37. Kvíz 8. Který přirozený proces přenosu genetické informace napodobuje metoda PCR? A) translaci B) transkripci C) replikaci

38. Kvíz 9. Co je to genetický otisk prstu, tzv. DNA fingerprint? A) část genomu, kterou dědíme po jednom z rodičů B) DNA profil osoby získaný pomocí PCR, který slouží obzvláště v kriminalistice k identifikaci osob C) klasický otisk prstu, který pachatel zanechal na místě činu společně s kouskem své tkáně, ze které kriminalisté v laboratoři získají DNA

39. Kvíz 9. Co je to genetický otisk prstu, tzv. DNA fingerprint? A) část genomu, kterou dědíme po jednom z rodičů B) DNA profil osoby získaný pomocí PCR, který slouží obzvláště v kriminalistice k identifikaci osob C) klasický otisk prstu, který pachatel zanechal na místě činu společně s kouskem své tkáně, ze které kriminalisté v laboratoři získají DNA

40. Kvíz 10. Co je to PCR artefakt? A) starobylá DNA (tzv. ancient DNA) zkoumaná pomocí PCR B) chyba DNA polymerázy, kdy do nového řetězce zařadí nesprávný nukleotid C) označení prototypu termocykleru se třemi vaničkami s vodou o různých teplotách, ve kterých probíhaly první PCR reakce

41. Kvíz 10. Co je to PCR artefakt? A) starobylá DNA (tzv. ancient DNA) zkoumaná pomocí PCR B) chyba DNA polymerázy, kdy do nového řetězce zařadí nesprávný nukleotid C) označení prototypu termocykleru se třemi vaničkami s vodou o různých teplotách, ve kterých probíhaly první PCR reakce