Janine Kamke , Michael W Taylor and Susanne Schmitt, 2010

1. Activity profiles for marine sponge associated bacteria obtained by 16S rRNAvs 16S rRNA gene comparisons • Janine Kamke, Michael W Taylor and Susanne Schmitt, 2010 Benaïssa Meriem KlouchKhadidjaZeyneb

2. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Introduction  La connaissance sur la diversité bactérienne chez les éponges a beaucoup évolué, des études précédentes ont pu déterminer les processus des microorganismes au sein de leur hôte. Ceci a attiré l’attention et la curiosité des chercheurs (Kamke et al., 2010) qui dans leurs recherches, se sont intéressés à l’étude de l’activité bactériennechez deux éponges Ancorinaalataet Polymastiasp., Pour cela ils ont d’abord commencé par l’identification de ces bactéries en se basant sur le gêne 16S rRNA puis l’activité de ces symbiontes en comparant ce même gène au gêne 16S rRNA dérivé.

3. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Matériel et méthodes • Echantillonnage des éponges • Baie de Mathesonset baie de Jones (Nouvelle Zélande du Nord-Est) de novembre/décembre. • Echantillonnage de 3 individus de chacune des 2 éponges • ( Ancorinaalata et Polymastiasp.)par plongée sous-marine à une profondeur de 3 à 10 m. Prélèvement des tissus Lyophilisation • Observation par (TEM)

4. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Extraction de l’acide nucléique et construction des clonothèques du gène 16S rRNA/ 16S rRNa • Extraction d’ADN/ARN à partir des tissus lyophilisés par AllprepDNA/RNA mini kit • Purification de l’ADN et sa transcription en cDNA • Amplification des gènes (ADN, cDNA) par PCR amplifiée • Union des produits de la PCR • Construction des clonothèques (d’ADN et cDNA) • Sequençage par Macrogen avec suppression des mauvaises séquences parPintail • Introduction des séquences finales dans une base de données (DDBJ/EMBL/GenBank).

5. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Analyses statistiques et phylogénétiques - Estimation de la richesse non paramétrique par le calcul du Chao1 en utilisant DOTUR - Regroupement des séquences d’ADN et de cDNA plus ou moins similaires par le serveur BLAST - Alignement des séquences par SINA aligner - Correction manuelle de l’alignement après introduction dans une base de données de 16S rRNA (ARB –SILVA) - Construction des arbres phylogénétiques en se basant sur le maximum de probabilité,maximum de parcimonie et la méthode de neighbor-joining • -Calcul du bootstrapspour évaluer la stabilité desbranches.

6. Résultats et interprétation Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Polymastia sp. Ancorinaalata 2 µm 1 µm Figure 1.Aspect du tissumesohylsous microscope électronique à transmission issu des éponges marines (a) Ancorinaalataet (b) Polymastia sp. • A.alata considérée comme appartenantà la catégorie des éponges à forte abondance bactérienne. Polymastiaspconsidérée comme appartenant à la catégorie des éponges à faible densité bactérienne.

7. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Tableau 01. Résultats des calculs de Chao1 (théorique) et OTUs (observés). • Chao1 : Estimateur de richesse non paramétrique a été calculé à différents seuils d’OTUs (95% et 99%) afin d’évaluer la richesse dans chaque clonothèque.

8. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Tableau 02.Résultats de l’observation TEM et des résultats du séquençage ChezAncorinaalata, • Existance de 8 phyla de bactéries. • Les bactéries associées à Ancorinaalatasont à la fois présentes dans les séquences de DNA et de RNA. • Une exception concernant Nitrospira qui n’a pu être identifiée qu’à partir des séquences de RNA. • Les bactéries présentant de fortes abondances sont les Gammaproteobacteria suivies des Chloroflexi.

9. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion ChezPolymastiasp., • Existence de 3 phyla seulement. • 1/3 des clones de RNA et presque tous les clones de DNA contenaient les deux groupes de bactérie Alphaproteobactérie et Actinobactérie. • Ces deux taxons pourraient être considérés comme étant les vrais symbiontes des Polymastiasp. • Les Gammaproteobacterie et les Spirochaetes ont été trouvé seulement dans les clones de DNA. • La présence des bactéries à la fois dans les clonothèques de DNA et de RNA indique l’abondance et l’activité de ces bactéries au sein de leur hôte. • L’absence des bactéries dans les clonothèques de RNA indique leur très faible activité. • La présence des bactéries dans les clonothèques de RNA et absence dans le DNA indique que ces bactéries sont rares mais fortement actives.

10. 40 A.alata ARN 30 20 ADN 10 Alpha Delta Gamma 0 Nitrospira Chloroflexi Spirochaetes Acidobacteria Actinobacteria Bacterioidetes Uncert.lineage Gemmatimonadetes # de clones 90 Polymastiasp. 80 70 30 ADN 20 ARN 10 Delta Alpha 0 Gamma Nitrospira Chloroflexi Spirochaetes Acidobacteria Bacterioidetes Uncert.lineage Actinobacteria Gemmatimonadetes Figure 2. Distribution phylogénétique des clones de bactérie récupérés des clonothèques d’ADN et d’ARN à partir des éponges marines Ancorinaalata(haut) et Polymastiasp.(Bas).

11. Polymastiasp.RNAclonePol93 Polymastiasp. RNA Pol444 Tethyaaurantium clone TAI-2-153,AM259780 Marine clone TLC-FL2-28,EF37946 Marine clone 6C233196,EU805202 Figure 3. Arbrephylogénétiquebasésur la 16S rRNA de Gammaproteobacteriaassociée aux éponges.

12. AncorinaalataRNA clone AncK45 • AncorinaalataDNA clone AncE9 • AncorinaalataDNA clone AncB10 • AncorinaalataRNA clone AncL11 • AncorinaalataDNA clone AncA15 • AncorinaalataDNA clone AncB22 • AncorinaalataDNA clone AncB21 • AncorinaalataDNA clone AncB4 • AncorinaalataRNA clone AncL34 • Theonellaswinhoei clone PAWS52f,AF186417 • Ancorinaalata DNA clone AncD16 • Agelasdilatata clone AD047,EF076135 A4 AncorinaalataDNA clone AncD21 AncorinaalataDNA clone AncD30 * AncorinaalataDNA clone AncD45 Oculinapatagonia(coral) clone c1uc49 Alphysinaaerophobaclone TK16, AJ347035 Plakortissp. Clone PK044,EF076096 Xestospongia muta clone XmE179, EF159906 Figure 4 .Arbrephylogénétiquebasésur la 16S rRNA de Chloroflexi et des organismesaffiliésassociés aux éponges.

13. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion rRNA Activité • La présence des bactéries à la fois dans les clonothèques de DNA et de RNA indique l’abondance et l’activité de ces bactéries au sein de leur hôte. • L’absence des bactéries dans les clonothèques de RNA indique leur très faible activité. • La présence des bactéries dans les clonothèques de RNA et absence dans le DNA indique que ces bactéries sont rares mais fortement actives.

14. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Taux de rRNA Corrélation ? Corrélation? Croissance cellulaire Activité Le niveau de rRNA est généralement corrélé avec le taux de croissance cette approche est valable pour la plupart des bactéries, mais pas toutes, car les bactéries oxydant l’ammoniaque conservent des concentrations élevées en rRNA même pendant des périodes ou elles sont supposées avoir une activité minimale. Aussi parfois de petites cellules qui concentrent des taux faibles de rRNA alors qu’elles sont métaboliquement très actives.

15. Introduction Matériel et méthodes Résultats et discussion Conclusion Conclusion Dans cette étude très récente les chercheurs ont pu montrer avec succès l’approche de l’application du 16SrRNA gène Vs 16SrRNA dérivé des bactéries associées aux éponges, ils ont pu fournir les premiers aperçus sur l’activité in situ des lignées bactériennes non cultivées et spécifiques aux éponges. Cette approche permet également l’identification des phylotypes. Ils sont arrivés a évaluer l’activité des symbiontes au sein de leur hôte mais cela reste quand même quantitatif vu qu’ont ne sais pas encore exactement la fonction spécifique de chaquebactérie active.