Review : tecniche di rivelazione di attività elettrica neuronale

1. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Review: tecniche di rivelazione di attività elettrica neuronale Jacopo Lotti Laboratorio Europeo di Spettroscopia Non-lineare Università di Firenze

2. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Neurone e Impulso corpo cellulare (soma o pirenoforo) INPUT assone dendriti sinapsi Impulso elettrico OUTPUT

3. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Letteratura: alcune funzioni note • L'attività elettrica spontanea dei neuroni nel SNC regola molti processi fondamentali di sviluppo del sistema nervoso, tra cui: • migrazione neuronale (Komuro & Rakic, 1992, 1998), • escrescenza degli assoni (Gu et al.. 1994; Catalano & Shatz, 1998), • selezione del fenotipo del trasmettitore (Gu et al., 1994), • modellamento dendritico (Wong & Ghosh, 2002), • attivazione dei recettori del trasmettitore (Liao et al., 2001), • protrusione sinaptica (Shatz & Stryker, 1988; O'Leary et al., 1994), • espressione di, liberazione di, e ricettività alle neurotrofine (Blochl & Thoenen, 1995; Meyer-Franke et al., 1998; Shieh & Ghosh, 1999), • apoptosi (morte cellulare programmata) (Svoboda ed altri. 2001), • sviluppo di tipologie di canale ionico maturi (Desarmenien & Spitzer, 1991; Linsdell & Moody, 1994, 1995; Dallman et al., 1998; Grosse et al., 2000).

4. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Comunicazione e Codificazione Neuroni: comunicano tra loro con “linguaggio” elettro-chimico tramite le sinapsi Sinapsi: aree circoscritte deputate alla trasmissione unidirezionale dell’informazione nervosa Informazione: codificata in termini di transienti di attività elettrica chiamati Potenziali d’Azione (inglese “spikes”). Meccanismo di azione: ON / OFF

5. NJC, Febbraio 2009 colore rosso Occhio: retina e nervo ottico Neuroscience Journal Club Stimolo: Dove e Quando Collocazione spaziale: area cerebrale interessata Dominio temporale: frequenza di firing tempo Quali e quanti neuroni? Sincronie tra neuroni? Pathway dello stimolo? Ripetizione dello stesso pathway?

6. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Stato dell’arte • Ottica • Lineare: • - Singolo-fotone • Non-lineare: • - Due-fotoni • - Generazione Seconda Armonica (SHG) • Microelettrodi • Patch-clamp • Micro electrode array (MEA) • Elettroencefalografia (EEG) • EEG intracranica (iEEG) • Elettromagnetica (?) • Magnetoencefalografia (MEG)

7. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club MICROELETTRODI

8. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Patch-clamp Permette di studiare le correnti ioniche cellulari trans-membranarie, cioè le variazioni di conduttanza della membrana cellulare  potenziali d’azione. Pipetta di vetro con microelettrodo all’interno Tecnica:isolare elettricamente un’area piccolissima (patch) di membrana, e registrare le correnti ioniche che fluiscono attraverso i canali ionici presenti. Il potenziale in uscita è proporzionale alla corrente applicata all’ingresso invertente (-), cioè alla corrente che passa nel patch di membrana isolato dalla bocca dell’elettrodo.

9. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Patch-clamp CONFIGURAZIONI: Grafico di potenziali di membrana indotti tramite patch-clamp in configurazione whole-cell (voltage-clamp) Ogni linea colorata corrisponde al potenziale di membrana raggiunto da una cellula del Purkinje con un “holding potential” di –70 mV in seguito all’induzione di transienti elettrici ad amperaggio crescente. In alto a sinistra, tabella con i rispettivi valori di elettricità indotta ad ogni ripetizione. Cell-attached: registrazione delle correnti di pochi o singoli canali. Whole-cell: registrarzione delle correnti ioniche che attraversano tutta la membrana

10. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Patch-clamp • Applicazioni • Registrazioni molto accurate in singola cellula (extra- e intracellulari) • Difficilmente estendibile a: • - più di due cellule per volta • - cellule molto vicine • - diverse aree della stessa cellula contemporaneamente • Ottimo per esperimenti in vitro • Ottimo, ma invasivo, in vivo

11. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Micro-electrode array (MEA) Particolare centrale della retina: vi confluiscono 60 microelettrodi disposti ordinatamente in un’area di 800 m2; la distanza tra due elettrodi adiacenti è di 100m. (www.ayanda-biosys.com/mea_biochips.html) MEA chip commerciale (Ayanda Biosystems SA): camera di registrazione (circolare) circondata da 60 microelettrodi che confluiscono nell’area centale della camera di registrazione (retina).

12. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Micro-electrode array (MEA) Registrazione MEA: profilo laminare ippocampo area CA1. A) Fettina di ippocampo spessa 350 μm posizionata su 800 × 800 MEA. Elettrodo rosso: stimolazione fibre collaterali. Elettrodi gialli: elettrodi allineati in parallelo ai dendriti apicali di neuroni piramidali in area CA1. Registrazione risposta sinaptica in vari strati. Linea verde: strato corpi cellulari. Distanza tra gli elettrodi: 100 μm. B) Grafico attività eccitatoria registrata dagli elettrodi gialli (da 1 a 5) in risposta ad un transiente elettrico applicato all’elettrodo di stimolazione. Kopanitsa et al., BMC Neuroscience 2006, 7: 61

13. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Micro-electrode array (MEA) • Applicazioni • Registrare attività di campo • Esperimenti in vitro o ex vivo (fette acute di tessuto) • Difficilmente estendibile in vivo • Impossibile registrare attività con risoluzione di singola cellula Singolo corpo cell 8 - 20m 100m

14. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Elettroencefalografia (EEG) Registra attività ritmica e transienti elettrici encefalici Attività elettrica: corrente post-sinaptica (la corrente extracellulare genera il voltaggio) registrata tramite elettrodi posizionati sullo scalpo. Rivela la somma dell’attività sincrona di migliaia di neuroni aventi simile orientamento spaziale, perpendicolare rispetto allo scalpo Attività ritmica: è divisa in bande di frequenza (onde alfa, beta, gamma, delta e teta). Applicazioni • Benefici: • non invasiva • non necessita collaborazione del soggetto esaminato • Limiti: • - risoluzione temporale dell’ordine del millisecondo • scarsa risoluzione spaziale • sensibilità selettiva: • > strati superficiali della corteccia, sulle creste (radiali allo • scalpo) • < dendriti in profondità o producenti corrente tangenziale • allo scalpo • oscuramento sorgente intracranica: meningi, liquor cerebrospinale

15. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club EEG intracranica (iEEG) Si inseriscono elettrodi nel cranio, nei pressi della superficie encefalica, sotto la superficie della dura. Ciò avviene in seguito ad una craniotomia. Questa tecnica prende varie denominazioni: EEG intracranica (iEEG), elettrocorticografia (ECoG) e EEG subdurale (sdEEG). Gli elettrodi possono anche essere inseriti in strutture encefaliche profonde (amigdala, ippocampo etc), aree non facilmente accessibili tramite EEG convenzionale. Il segnale elettrocorticale è processato nello stesso modo dell’EEG, tramite una coppia di cavetti • MRI strutturale. Posizione elettrodi 8x8 cm. • In rosso: elettrodo 55. • ECoG: risposta dell’elettrodo 55 (tempo-frequenza) • Rosso: alta potenza • Blu: bassa potenza

16. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club OTTICA

17. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Coloranti voltaggio-sensibili (VSD) Le molecole di VSD si intercalano perpendicolarmente alla membrana plasmatica. Durante un potenziale d’azione, tali molecole si dispongono parallelamente al campo elettrico indotto. intensità segnale emesso  intensità transiente elettrico (Peter Baker, Dept. of Biology, Arizona State University). • Risoluzione temporale: fino a ~ 0,1 ms • Risoluzione spaziale: fino ad 1 m ; dipende dal tipo di microscopia ottica combinata • Tossicità: da moderata ad elevata • Tempo di vita: da 10 min ad alcune ore • Applicazioni: in vivo ed in vitro, ma non sull’uomo • Vantaggi principali: indicano “dove” e “quando”; indagine non invasiva

18. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Microscopia Lineare e Non-lineare Non-lineare Lineare • Eccitazione elettronica (spettro del visibile): • Lineare = interazione 1 fotone ad alta energia + 1 elettrone • Non-lineare = interazione simultanea 2 fotoni a bassa energia + 1 elettrone  alta probabilità spazio – temporale di interazione Fluorescenza Non-lineare  dipende in maniera non-lineare dalla densità fotonica: L- eccitazione del mezzo nei coni superiore ed inferiore rispetto al fuoco N- confinamento spaziale del volume di eccitazione nella regione focale L- elevato scattering (diffusione luminosa nel mezzo) N- scattering estremamente ridotto Comunemente l’assorbimento non-lineare di sonde fluorescenti avviene nello spettro dell’infrarosso (  700 - 1000 nm): N- maggiore capacità di penetrazione nel tessuto e minorefoto-danneggiamento tissutale (rispetto ad L) piano focale Microscopia Non-lineare = Risoluzione Micrometrica in Profondità nei Tessuti

19. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Microscopia Lineare e Non-lineare IMAGING LINEARE NON-LINEARE • IN VITRO: • molti neuroni simultaneamente; • assenza di vincoli spaziali; • buona risoluzione della singola cellula in vitro • o in sezioni estremamente superficiali di tessuto 2-PE (Fluorescenza ad Eccitazione a due-fotoni) INCOERENTE SHG (Generazione di Seconda Armonica) COERENTE • IN VITRO : • molti neuroni simultaneamente; • assenza di vincoli spaziali; • ottima risoluzione della singola cellula • IN VITRO e EX VIVO: • molti neuroni simultaneamente; • assenza di vincoli spaziali; • ottima risoluzione delle • membrana della singola cellula IN VIVO: diffusione della luce in profondità in tessuti intatti inomogenei (es.: in vivo ed ex vivo)  degradazione irreversibile della risoluzione spaziale IN VIVO: NO diffusione di luce in profondità in tessuti intatti inomogenei (es.: in vivo ed ex vivo)  ottima risoluzione spaziale (micrometrica) IN VIVO: IMPOSSIBILE: quasi totalità del segnale è direzionale in “forward scattering”

20. NJC, Febbraio 2009 SHG:Coerente Molecole orientate casualmente Psegnale  N Molecole allineate:Psegnale N 2 Neuroscience Journal Club Generazione di Seconda Armonica (SHG) NON-LINEARE: Interazione simultanea 2 fotoni a bassa energia + 1 elettrone NO Fluorescenza: Interazione simultanea (NO assorbimento / emissione): “trasferimento” di energia totale ed immediato IMAGING 2-PE:Incoerente Molecole orientate casualmente e allineate: Psegnale  N Neuroni di Aplysia in coltura. (Sacconi et al., 2006)

21. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Registrazione SHG di Potenziali d’Azione Misura dell’attività elettrica lungo un neurite di Aplysia mediante registrazione SHG da varie posizioni dello stesso neurone (Sacconi et al., 2006) (Sacconi et al., 2006) RASH Microscopy : • Sezione sagittale di cervelletto, profondità 90m • Attività elettrica simultanea di 5 cellule del Purkinje • Sovrapposizione tracce (b): studio sincronie • (Sacconi et al., 2008) (Dombeck et al., 2005) (Sacconi et al., 2008)

22. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club ELETTROMAGNETICA (?)

23. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Magnetoencefalografia (MEG) • Non invasiva: non richiede né iniezioni di isotopi né esposizioni a raggi-X • Misura campi magnetici generati dall’attività neuronale: misura diretta delle funzioni cerebrali • Complementare ad imaging anatomico (es. risonanza magnetica) • Risoluzione temporale: 1 ms • Risoluzione spaziale: 1mm • Attività neuronale: campi magnetici sono situati ovunque ci sia un passaggio di corrente ELETTRICA, sia in un filo sia in una cellula nervosa… • Si misura l’attività di campo e non della singola cellula

24. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Magnetoencefalografia (MEG) • Il campo magnetico passa inalterato attravarso il tessuto cerebrale e le ossa del cranio: può essere registrato fuori dalla testa • Il campo magnetico è estremamente piccolo: viene rivelato da sofisticati sensori basati sulla superconduttività (SQUID)

25. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Magnetoencefalografia (MEG) Analizzando la distribuzione spaziale del campo magnetico, usando come modello un singolo dipolo, è possibile stimare la localizzazione intracranica della sorgente generatrice e sovrapporla ad un Imaging in Risomanza Magnetica (MRI)

26. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Conclusioni • In generale, il numero delle unità funzionali che formano una rete neuronale (il numero di cellule interrogate) è inversamente proporzionale alla specificità del segnale raccolto dalle singole unità funzionali: • Patch-clamp e 1-PE (in vitro): una sola cellula (o al massimo due nel patch-clamp)  attività altamente caratterizzata • MEA, EEG e MEG: molte cellule  visione di un’attività media di gruppo • Microscopio RASH (ex vivo), o un RA 2-PE (anche in vivo!)  è possibile superare tale limite studiando l’attività elettrica di gruppi di neuroni mantenendo l’acquisizione di dati al livello delle singole cellule

27. NJC, Febbraio 2009 Neuroscience Journal Club Grazie dell’attenzione