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2. 2 Cosa si intende per trasformazione ?
In biologia molecolare la trasformazione è la replicazione di DNA estraneo in una cellula batterica.
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4. 4 Escherichia Coli Regno:Bacteria
Phylum:Proteobacteria
Classe:Proteobacteria Gamma
Ordine:Enterobacteriales
Famiglia:Enterobacteriaceae
Genere:Escherichia
Specie:E. coli
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7. 7 Metodi di trasformazione
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12. 12 Metodi fisici Shock termico:
Vengono utilizzate cellule di E. Coli rese competenti tramite un trattamento chimico che permette di rendere labili le pareti cellulari.
I batteri sono posti a contatto con il plasmide di interesse e lasciati in ghiaccio per 30 minuti.
In questo periodo di tempo il DNA aderisce alla membrana cellulare.
13. 13 Successivamente le cellule vengono poste in un bagnetto a 37° o 42°C (a seconda del ceppo batterico utilizzato) per 30 secondi. In questa fase le membrane formano dei pori e possono assorbire il DNA nudo. I batteri sono rimessi in ghiaccio per 2 minuti. Viene aggiunto il terreno di coltura (generalmente LB) e messi sulla ruota all’interno dell’incubatore a 37°C per un’ora.
14. 14 Metodi fisici Elettroporazione:
Elettroporatore
ECM 830
15. 15 Le cellule sono poste in una soluzione contenente DNA e soggette a un breve impulso elettrico che produce transitoriamente l’apertura di pori nelle loro membrane.
Attraverso i pori il DNA entra direttamente nel citoplasma.
Poiché le cellule di E.Coli sono piccole richiedono campi elettrici molto elevati per l’elettroporazione, rispetto a quelli usati per introdurre il DNA nelle cellule eucariotiche.
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La più alta efficienza di trasformazione si ottiene quando la concentrazione di DNA è elevata.
L’elettroporazione è temperatura dipendente e la migliore si ottiene a 0-4°C.
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18. 18 L’efficienza di trasformazione tramite elettroporazione è influenzata da numerosi fattori:
La potenza del campo elettrico applicato:a basso voltaggio le membrane plasmatiche non sono sufficientemente alterate per permettere il passaggio del DNA, a elevato voltaggio le cellule sono irreversibilmente danneggiate.
L’ampiezza dell’impulso elettrico.
La temperatura.
Concentrazione del DNA.
Composizione ionica del mezzo.
19. 19 Microiniezione
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22. 22 Metodi chimici Trasformazione con cloruro di calcio:
Tutti i metodi chimici si basano sull’osservazione che batteri trattati con soluzioni fredde di ioni bivalenti lasciano entrare DNA nudo in modo più efficiente. Si ipotizza che l’aggiunta di ioni bivalenti (Ca++), mascherando le cariche negative del DNA, ne favorisca l’ingresso nella cellula di E. coli.
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27. 27 Metodo di Hanahan
Il microbiologo americano Douglas Hanahan ha creato molti dei ceppi di E. coli di uso comune (es. DH5a, DH10B).
Il metodo da lui sviluppato usa una “soluzione trasformante” ottenuta misurando l’aumento di efficienza di una soluzione base cui venivano aggiunti uno alla volta diversi componenti.
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30. 30 Metodi biologici Lipofezione:
Il DNA può essere
incorporato entro
vescicole lipidiche
artificiali dette liposomi.
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