I.T.I.S. “E.Divini” Anno scolastico 2004/2005 Paparoni Fabio

1. I.T.I.S. “E.Divini” Anno scolastico 2004/2005 Paparoni Fabio ANALISI DELLA FRAZIONE INSAPONIFICABILE DELL’OLIO DI OLIVA TECNICHE GASCROMATOGRAFICHE

2. UN PO’ DI STORIA DELL’OLIO Estratto dalle drupe dell’ Olea Europea, la sua origine è antichissima. Comparso per la prima volta probabilmente nell’Asia occidentale, ben presto si diffuse in tutta l’area mediterranea dove il suo culto fu consacrato da tutte le religioni. La sua storia, mista tra verità e leggenda, vanta origini diverse: conosciuto dagli Assiri e dai Babilonesi, per gli Egizi fu introdotto come dono dalla dea Iside; per i greci fu Minerva a far spuntare dalla terra la prima pianta di olivo, per gli Ebrei era già conosciuto dai tempi di Adamo, ma, qualunque sia stata la sua origine, l’olio ha sempre simboleggiato pace, fecondità, forza e purificazione.

3. Oggi, l’olio di oliva rappresenta uno degli alimenti maggiormente diffusi su tutte le tavole. Considerato uno dei componenti essenziali della dieta mediterranea, grazie al suo flavour, alla sua grande versatilità e alle sue svariate proprietà risulta essere tra i prodotti maggiormente ricercati sul mercato e, non meno che nel passato, gode della fama di alimento di grande qualità.

4. COMPOSIZIONE DELL’OLIO D’OLIVA L’olio di oliva, al pari di tutti gli oli vegetali, è composto da: FRAZIONE SAPONIFICABILE (99%) costituita da acidi grassi saturi e insaturi) variabili a seconda delle regioni di provenienza FRAZIONE INSAPONIFICABILE (1%) frazione estraibile con etere di petrolio dopo saponificazione della sostanza grassa con potassa alcolica

5. FRAZIONE INSAPONIFICABILE A questa frazione strettamente tipica, specifica e peculiare del prodotto, si devono: caratteristiche organolettiche dell’olio di oliva (profumi, aromi, odori, ...) capacità antiossidante maggiore possibilità di rilevare frodi

6. I costituenti della frazione insaponificabile sono: IDROCARBURI (30-50%) Tra i più rappresentativi vi è lo squalene: terpene costituito da sei unità isopreniche

7. ALCOLI (20-35%)molecole generalmente volatili, dotate di odore, cioè in grado di stimolare le nostre terminazioni olfattive

8. VITAMINE LIPOSOLUBILITra tutte, quella maggiormente presente negli oli di oliva è la vitamina E (2-3%) e soprattutto l’a-tocoferolo

9. POLIFENOLI (18-36%)molecole dotate di spiccata capacità antiossidante in cui compaiono più nuclei fenolici legati a radicali di varia natura

10. PIGMENTI COLORATIcomposti che impartiscono le colorazioni agli oli di oliva appartengono essenzialmente a due famiglie: • CAROTENOIDI Sono idrocarburi insaturi responsabili del colore giallo dell’olio Tra questi il più conosciuto è sicuramente il b-carotenechiamato anche provitamina A perché viene convertito dall’organismo stesso in vitamina A

11. PIGMENTI COLORATI • CLOROFILLA La loro concentrazione nell’olio è pari all’1%. Nell’olio svolge una duplice funzione: • È un ottimo conservante al buio • Favorisce l’ autossidazione dell’olio alla luce solare E’ presente come un miscuglio di clorofilla “a” di color verde-bluastro e di clorofilla “b” di color verde-giallo.

12. La nomenclatura di molti fa riferimento al colestano. Inoltre i gruppi sostituenti presenti lungo la catena sono indicati con “a” se si trovano sopra il piano della molecola, al contrario “b”. STEROLI Denominati anche steroidi, sono composti policiclici aventi quattro anelli condensati: tre sono nuclei cicloesanici ed uno ciclopentanico.Spesso hanno in posizione 3 un gruppo ossidrilico ed in posizione 17 una catena laterale alifatica; differiscono tra loro per la posizione e il numero dei doppi legami.

13. Sono presenti in quasi tutti gli organismi viventi ed in alcune specie (gli animali per esempio) svolgono funzione ormonale (testosterone, estradiolo). Sia come composti naturali, che di sintesi, gli steroidi hanno largo impiego in medicina.

14. Nell’olio d’oliva, sono normalmente presenti i seguenti steroli -5-avenasterolo -sitosterolo 94 %

15. stigmasterolo 1 - 2.5% campesterolo 2.5 - 4%

16. -7-stigmasterolo 1%

17. Sono i componenti più interessanti dal punto di vista analitico tra gli insaponificabili perché sono specifici e caratteristici per qualità e quantità. Inoltre la composizione sterolica negli oli resta invariata da eventuali modificazioni genetiche apportate alla pianta, che viceversa influiscono sulla composizione in acidi grassi. E’ proprio per questo motivo che tale parametro costituisce attualmente il più valido mezzo di indagine per la tutela dell’olio di oliva.

18. ESAME DELLA FRAZIONE INSAPONIFICABILE PREPARAZIONE DELLA FRAZIONE INSAPONIFICABILE 10 grammi di campione d’olio d’oliva + 100 ml di KOH 2N in etanolo riscaldamento sotto energica agitazione; a soluzione limpida ( saponificazione avvenuta), si procede per altri 20 minuti si travasa in un imbuto separatore, si versano 150 ml di etere etilico e dopo aver agitato energicamente si lascia riposare per qualche minuto fino a completa stratificazione delle due fasi si procede quindi alla loro separazione e su quella acquosa si effettuano altre tre estrazioni con 150 ml complessivi di etere sulla fase organica si controlla il pH neutro; in caso contrario si procede a successive estrazioni fino ad ottenere tale risultato tramite aggiunta di Na2SO4 si disidrata la fase organica

19. IDROLISI ALCALINA 1,2,3-tridodecanoilglicerolo glicerato (base forte) lega l’ H+ dell’acido grasso OH- si lega al carbonio carbossile dodecanoato di potassio

20. SEPARAZIONE DEI COMPONENTI TRAMITE TLC 0.3 ml di soluzione si depositano a 1.5 cm circa dal bordo inferiore di una lastrina cromatografica contenente come indicatore 2,7-difluororesceina si depositano come riferimento alcuni ml di una soluzione al 5% in cloroformio di colesterolo si deposita la lastrina all’interno di una camera satura di una soluzione 1:1 di esano-etere fino a che l’ eluente non l’abbia attraversata completamente si evapora il solvente in corrente di aria calda

21. Le macchie individuabili (dalla più alta alla linea di partenza) sono le seguenti: Carotenoidi Idrocarburi Tocoferoli Alcoli superiori e triterpenici colesteroloSteroidi Eritrodiolo e uvaolo

22. PREPARAZIONE DELLA FRAZIONE STEROLICA Dopo aver individuato la banda relativa gli steroli si evidenzia il bordo della stessa con una matita (sotto luce UV) e si raschia via l’area selezionata. Successivamente: si aggiungono 25 ml di etere si allontana il gel di silice mediante filtrazione si allontana il solvente mediante evaporazione si essicca in stufa a 100°C per 15 minuti

23. Essendo gli steroli composti poco adatti per essere sottoposti ad analisi gascromatografiche è opportuno trasformarli in trimetilsilileteri mediante aggiunta di: 0.2 ml di dimetilformammide 0.2 ml di bis(trimetilsilil)ammina 0.2 ml di trimetilclorosilano Acqua refrigerante 30 minuti a temperatura ambiente

24. Steroide trimetilclorosilano bis(trimetilsilil)ammina DMF (solvente) DMF La bis(trimetilsilil)ammina tampona l’HCl formatosi DMF trimetilsililetere DMF

25. È opportuno preparare contemporaneamente una lastina cromatografica così da poter individuare precisamente il punto di fine reazione Dove: R= reagente P= prodotto

26. GASCROMATOGRAFIA Realizzata nel 1941 dai premi Nobel Martin e Synge, è una delle tecniche strumentali di separazione, analisi quantitative e qualitative, più utilizzate e versatili in tutti i laboratori in quanto consente: • tempi di analisi molto ridotti • possibilità di separare, operando nelle opportune condizioni, qualsiasi miscela di sostanze • possibilità di effettuare analisi in serie, in quanto la stessa colonna può essere rigenerata di continuo dal gas di trasporto • alta sensibilità (quantità di sostanza analizzabile 10-5 / 10-12 g)

27. Le analisi gascromatografiche sono applicabili soltanto a sostanze volatili o comunque rese tali e vengono realizzate con uno strumento denominato appunto gascromatografo.

28. Esistono GC : • su colonne impaccate: la fase stazionaria formata da un solido granulare poroso o da un liquido depositato su un supporto costituito da particelle porose e inerti, occupa tutto il volume disponibile di una colonna d’acciaio o vetro lunga fino a 6 metri con un diametro interno di 0.75/0.4 mm • su colonne capillari: dove la fase stazionaria è depositata in forma di un film sottilissimo (0.1/5mm) lungo le pareti di una colonna capillare dal diametro interno di 0.1/0.75 mm, lunga fino a 100 metri all’interno della quale il gas di trasporto percorre il canale centrale del capillare.

29. Secondo lo stato fisico in cui si presenta la fase stazionaria si distingue tra: • colonne capillari aperte :fase stazionaria liquida • capillari aperte con rivestimento supportato:solido imbevuto di un liquido di ripartizione) • capillari aperte con rivestimento poroso: solido poroso • capillari a foro largo o wide boor: supporto solido imbevuto di un liquido. Permettono: • miglior contatto tra le due fasi • miglior efficenza • agevola il flusso del carrier • minimizza al massimo la caduta di pressione

30. STRUMENTAZIONE Azoto, elio, idrogeno, argon CARRIER microsiringhe o dispositivi a valvola che iniettano il campione in una “precolonna” (liner) che vaporizza la miscela INIETTORE COLONNA Mantiene costante la temperatura mediante aria calda (+0.05°C) CAMERA TERMOSTATICA RIVELATORE A termoconducibilità, a ionizzazione di fiamma, a cattura di elettroni,… ANALIZZATORE DATI abbondanza Emette un cromatogramma che riporta l’abbondanza dei picchi separati e il loro tempo di ritenzione T’r

31. SPETTROMETRIA DI MASSA Nata come metodo fisico per la determinazione degli isotopi, la spettrometria di massa è una tecnica analitica utilizzata per misurare la massa di una molecola dopo che essa è stata ionizzata. E’ uno strumento potente usato per identificare prodotti incogniti, per determinare quantitativamente composti noti e per chiarire le proprietà strutturali e chimiche delle molecole. Ora è applicata anche in GC come sistema di rivelazione dei componenti presenti nella miscela in quanto necessita di: • quantità di campione molto limitate (in alcuni casi meno di un picogrammo) • concentrazioni molto basse (fino a una parte per mille miliardi)

32. PRINCIPIO E FUNZIONAMENTO INTRODUZIONEDELCAMPIONE Le molecole del campione vengono frammentate in ioni per interazione con un fascio di elettroni con energia di circa 75 eV. Lo ione molecolare carico positivamente si frammenta (in parte), con formazione di molecole e/o radicali neutri, che non vengono rivelati dallo strumento, e di cationi e/o radicali cationi, separati dallo spettrometro in funzione del loro rapporto massa su carica (m/z) e rivelati da un analizzatore che lavora sotto un vuoto molto spinto. CAMERADIIONIZZAZIONE TRASFERIMENTOIONI ANALIZZATORE RIVELATOREIONI

33. La ionizzazione può essere di tipo: • elettronico (EI) : le molecole del campione interagiscono con un fascio di elettroni provocando l’espulsione di un elettrone dalla molecola e- + M ---> M.+ + 2e- • chimico (CI): il campione interagendo con ioni di un gas (metano) viene protonato (MH+) • a pressione ambiente : lavorando come la CI a pressione ambiente fornisce prestazioni migliori.

34. Gli spettrometri di massa più comunemente interfacciati con gascromatografi sono del tipo a quadrupolo. Nella camera di ionizzazione le sostanze vengono frammentate e inviate all’analizzatore costituito appunto dal quadrupolo: un sistema di quattro aste collegate elettricamente tra loro a due a due e sottoposte ad un potenziale che permette di “selezionare i frammenti” secondo il rapporto m/z.

35. GASCROMATOGRAFIA DELLA FRAZIONE STEROLICA • 2 ml di campione • fase stazionaria polare • fase mobile :azoto Una gascromatografia preliminare (nelle stesse condizioni) ha permesso di escludere i picchi fino a 4 minuti perché appartenenti ai reattivi utilizzati per la trasformazione degli steroli in TMSE

36. Frammenti del bis(trimetilsilil)ammina NSi2(CH3)3 ANALISI DEGLI SPETTRI DI MASSA Si(CH3)3 (Si(CH3)3)2

37. Frammenti costituiti dall’isotopo 13 del carbonio 12 221 M - CH3 (205) 206 picco molecolare (220) BHT: composto antiossidante utilizzato come stabilizzante nell’industria plastica deriva dalle tettarelle

38. FTALATI : composti utilizzati nell’industria dei giocattoli come ammorbidenti delle plastiche Derivano dai contenitori dei reattivi utilizzati

39. Frammenti dello SQUALENE isoprene Le macchie in TLC non sono state separate accuratamente

40. M+-H2O M+-H2O-CH3 b-sitosterolo

41. C3H7 C4H9 • curva tipica a campana IDROCARBURO C27H56 • picchi di 14 unità in 14 frammenti di altri steroli presenti nel campione

42. Una generica GC degli steroli presenti in un olio d’oliva Frammenti di steroli

43. CONCLUSIONI Alla luce dell’interpretazione dei risultati ottenuti e confrontando il cromatogramma e più precisamente l’abbondanza dei picchi presenti, in relazione allo spettro di massa di ogni picco, è possibile dedurre che la frazione isolata presenta: • per la maggior parte residui dei reattivi utilizzati nella reazione: primo fra tutti la bis(trimetilsilil)ammina, • alcuni frammenti di BHT • alcuni frammenti ftalati • ridotte quantità di steroli