Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II

1. ExpresiónDiferencial del Genoma en el Desarrollo - II Biol 3019 Biología del Desarrollo Universidad de Puerto Rico-Aguadilla JA Cardé, PhD

2. Objetivos • Repasar los conceptos de equivalenciagenómica y de expresióndiferencial del genoma. • Repasar la anatomía de un gen y del mRNA • Promotores, enhancers, • TF y silencers • Explicar los mecanismos de transcripcióndiferencial • Discutir el procesamientodiferencial del mRNA • Resumir los mecanismos de controldeexpresióngenética: transcripcional, traduccional, pos-traduccional; y susimplicaciones en el desarrollo.

3. Mecanismos de Transcripcióndiferencial TF: Ya se sabequienes son, pero no se sabíasurol? ChIP-Seq Technique: Aislar y crosslink la cromatina Cortar el DNA (sonicación/enzimas) Incubar con AB vs la proteína de interés Precipitarcomplejo AB-Prot-DNA Separar el DNA, PCR y secuenciar

4. Mecanismos de Transcripcióndiferencial • ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores • High CpG content promoters • Default ON, DNA no metilado activo; parainactivarlometilarlashistonas • En genes de control del desarrollotemprano • Regulan la síntesis de TF y otrasproteínasreguladoras • Low CpG content promotors • proteínascaracterísticas de etapastardías, célulasmaduras • Defaults OFF: DNA metilado inactivo, hay quedemetilar y estopermitemodificarlashistonas (H3K4me3) y la RNA pol II entra.

5. Transcripcióndiferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch • Histonasmetiladaspara?________________ • … y el DNA? En lascitosinas del promotor • 5 Metilcitosina (5ta base) estabilizanucleosomasprevienetranscripción • Presente en 5% de las C (seguidaspor G) luego de la replicación • Regulacióntranscripcional en vertebrados • Metilación del DNA: • Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada • Facilitareclutamiento de metilasas y deacetilasas, estabilizando el nuclesomaparaevitartranscripción (MeCP2)

6. Transcripcióndiferencial: mecanismosMetilación del DNA: ON/OFF switch

7. Como comparan en (términos de metilación) el promotor de lasglobinas en RBC inmadurosvs RBC madurosdurante el desarrollo?

8. Metilación: Patronesheredables: DNMT3DNMT1 DNA CpG | | DNMT3 (de novo) | | DNMT1 (forever) Asignado: 3 estados de la cromatina: activa, reprimida o “poised” (pag 51).

9. RNAProcesamientoDiferencial: • La clave de la diferenciacióncelulares la síntesis de diferentesproteínas en diferentestipos de células • En bacteria el control es: transcripcion, traduccion y postraduccion • En eucariota:uno mas; procesamiento y transporte • Splicing isoforms: • En humanos 90% de los genes lo usan • “Human Genes are multitaskers” – Christopher Burge • Genoma: 20,000 genes <Proteoma: 20,000 proteínas

10. Alternative Splicing Variants

11. Bcl-XSvsBcl-XL:- large Bcl = inhibe apoptosis- short Bcl = induce apoptosisen tumorescualpredomina? • Spliceosome • Factores de splicing • - Expresadosdiferencial-mente • snRNA U1 y SF2 en 5’ • U2AF en 3’

12. RNAProcesamientoDiferencial:ER -DrosphilaDscam gene La clave de la diferenciacióncelulares la síntesis de diferentesproteínas en diferentestipos de células Splicing isoforms:

13. Altenative Splicing: FGF • IIIbvsIIIc • Ambos en entre ex 7 y 8 • En mesenq IIIC: mesodermo • En epitelio IIIB :ectodermo • Metilacionesmarcan splicing

14. Splicing enhancers y recognition factors • Splicing enhancer (cis) sequences (SES) • Cerca de sitios de splicing • Promueven el ensamblaje del spliceosome • Recognition factors (trans) proteins • Reconocenlas SES y reclutan el splicesoma • Polypirimidine track binding proteinas (PPT) reprimen la formacion del spliceosoma • Hay señalesquesugierenque el contextotambienesimportante

15. AplicaciónclínicaMutaciones en splicing sites: • La mayoriaresultan en proteinas NO funcionales • Distrofina: mutación en un “splicing site” causaque se salte el exón • Myostatin gene: mutacion en el induce personas mas “fuertes” • Su proteinaes un reguladornegativo de division celular muscular • Hipertrofia muscular – comomiostatina no esta, el musculo se siguedividiendo hasta mas tarde: musculos mas grandes

16. Myostatin Knockout

17. Control: Niveltraduccional:longevidaddiferencial Longevidaddiferencial del mRNA : media vida del mRNA Mientras mas estable mas dura y mas copias de la proteína Longitud del poli A, secuencias en el 3’UTR para mayor longevidad Estabilización de ciertos mRNA en ciertosmomentos en ciertascélulas mRNA caseína : 1.1 hr en tejidomamariovs 28.5 hrs en lactancia (prolactina)

18. Control: Niveltraduccional:Inhibicionselectiva de mRNAs Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs que se usaránsolamenteluego de fecundación. Se mantienen en estadodurmiente hasta quellegue la señal: polaridad / iones Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox) Regulacióntraduccional “negativa”: inhibidores

19. Control: Niveltraduccional:Inhibicionselectiva de mRNAs • Circularización de mRNA • - 5’ cerca de 3’ • eIF4E + • eiF4A (helic) • eiF4G (scaf) • poliABP • Maskin • CPEB (3’UTR) (uuuuau) • eIF4E • Fosforilacion de CP y Maskinactiva 5’Cap, 3’ Poly A ; si no estan no traduccion

20. Control: Niveltraduccional- Tienenfavoritismos los ribosomas? NO!- a favor: mRNAs de Euc son traducidosporribosomas de Proc- sistemareticuloendotelial: traduccionporexcelencia SI: Selectividad ribosomal – Ribosomastienenproteinasdistintasdependiendo del tejido Observación de un gen quecausabadeformidadesqueleto axial Por la traduccióndiferencial del gen : Rpf38 Proteina 38 del ribosoma en lassomitas, controlaexpresion del Hox6 Deficiencia de Rpf38 causadeformidad vertebral Rpf38  Hox6

21. Control: Niveltraduccionalpuede el RNA comolasproteinasunirse a un acidonucleico y bloquearlo? SI microRNAs – eficiente y específicomedio de regular la traduccion de un mRNA Pequeños, complementarios a mRNA o parte de el Anti sense RNA, primeravez en C elegans Lin-4: RNA 21nctds  silencia mRNA de lin 14 uniéndosea su 3’UTR, marcadoparadegradación Lin14 usado en larva temprana, luegoinactivado miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales

22. Conservado • El precursor tienevarios repeats, cadauno forma un loop • Estosloops son procesadosporDrosha y Dicer (RNAsas • Estaslo hacenSS RNA • Empacado en RISC • Argonauta • Se unen al 3’UTR • - Inhibentraducción • - Perfect

23. Prim-DroshaPrem-DicermicroAgo

24. microRNAs miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y diferenciacion miR181 – esencialpara la determinacion de celulasprogenitoras en celulas B miR430 – operacionlimpieza de mRNAs maternales el ovocitounaveztraducidos (zebra fish) Fine tuning de Nodal: determinacion de ectodermo/endodermo Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el 5’ mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce? Texel sheep: myostatin Mutacion en el previenesplicing hipertrofiamuscular, pordeficiencia de miostatina Otra forma: transicion AG en 3’UTR, mir1 y mir 206, degradan el mRNA

25. Control de expresion de RNA: localizacióncitoplásmica • Se regula el timing y la localizacion de la expresion • 3’UTR – represionselectiva y localizacionselectiva • 3 mecanismos de localizacion • Difusion y anclajeporproteinasactivadoras (nanos) • Proteccionporlocalizacion (hsp83) • Libredifusioncomonanospero no esdegradada en unaszonasespecificas (polo posterior)

26. Transporteactivo (mecanismo mas usado) • Proteinasmotorasligan el 3’UTR y lo transportan • Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)