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Mutações

INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO DO DNA Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva. Mutações. ESTABILIDADE GENÉTICA. SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO. REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA REPARO DO DNA. Falhas. Aberrações cromossômicas: mudança no genoma

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Presentation Transcript

  1. INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO DO DNA Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Mutações

  2. ESTABILIDADE GENÉTICA SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA REPARO DO DNA Falhas Aberrações cromossômicas: mudança no genoma Mutações no DNA: doenças genéticas (câncer)

  3. MUTAÇÃO: qualquer mudança na sequência de nucleotídeos ou arranjo do DNA Células germinativas: Mutação herdável Células somáticas: Mutação somática

  4. Mutações genômicas: numéricas (aneuploidias) • Mutações cromossômicas: estruturais • Mutações gênicas: mutação de ponto

  5. MUTAÇÕES – LINHAGEM GERMINATIVA OVOCITOGÊNESE: ovócitos formados até 5o mês: número de divisões celulares do zigoto até oócito fertilizado constante: 24-31 divisões → erro de não-disjunçãocom aumento da idade (aneuploidias) • ESPERMATOGÊNESE: 30-31 divisões celulares até puberdade + 5 div. p/espermatogênese (23 ciclos/ano): centenas de divisões celulares dependendo da idade: 30+5[23x(25-13)]= 310 divisões • divisões celulares contínuas → risco maior de erros de replicação do DNA → 1/10 espermatozóide → mutação deletéria nova • Exemplos: Neurofibromatose • Acondroplasia • Hemofilia B • (avô materno: fonte da mutação nova)

  6. Agente mutagênico naturais BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES GÊNICAS Mutações espontâneas Mutações induzidas

  7. MUTAÇÃO ESPONTÂNEA • ausência de um tratamento com mutágeno: fonte de variação genética • Frequência baixa: uma célula em 105 a 108 • Mecanismos: • erros na replicação do DNA • lesões espontâneas: depurinação, desaminação e danos oxidativos (radicais superóxido-O2; peróxido de hidrogênio- H2O2; radicais hidroxila-OH) • elementos genéticos de transposição

  8. LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA • PERDA DE BASES: • Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula • Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula • REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb • REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação • TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por pb/divisão • GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA → menos 1 mutação de pb/divisão

  9. PREVENÇÃO DE ERROS • Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos potencialmente danosos, antes que reajam com o DNA • Exemplos: desintoxicação de radicais superóxido produzidos durante os danos oxidativos • a-  Enzima superóxido dismutase catalisa a conversão dos radicais superóxido  peróxido de hidrogênio • b-  Enzima catalase converte peróxido de hidrogênio em água

  10. MUTAÇÕES INDUZIDAS • Agentes químicos: • Análogos de bases: 5-BrdU • Alcilantes: EMS • Intercalantes: acridina orange • Agentes físicos: • Radiação UV • Radiação ionizante: raios X, gama • Agentes biológicos: • Vírus mutação insercional

  11. Absorção da luz UV Estado excitado de uma base púrica ou pirimídica Ligação covalente entre duas pirimidinas adjacentes Anel ciclobutano: dímeros de timina (TT) mais estável dímeros menos estáveis: CT, CC, TU e UU RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

  12. TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS 1. Substituição de Bases: Mutação de Ponto Mutação de sentido trocado (missense) Mutação sem sentido (nonsense) Mutação de processamento de RNA:destroem sítios consenso de corte; cap, poliadenilação, criam sítios crípticos: códons finalizadores emudança de matriz de leitura (frameshift) Mutações reguladoras: afetam a ligação de fator de transcrição e controle transcricional

  13. TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS 2. Deleções/Inserções: Adição/deleção: pouco no. bases Deleções maiores: Distrofina Inserção L1 ou Alu: hemofilia A (L1); neurofibromatose (Alu) Deleção/Duplicação (recombinação) Crossing-over desigual Expansão trinucleotídeos repetidos Repetição CAG: D. Huntington Repetição CGG: S. do X frágil

  14. POLIMORFISMO X MUTAÇÃO • POLIMORFISMO: variações no DNA • ocorrência de dois ou mais alelos relativamente comuns para um único lócus. • Variação do DNA na qual cada sequência possível está presente em pelo menos 1% da população. • Ocorre comumente e está associado a um fenótipo normal.

  15. Polimorfismo em sequência codificadora (5% DNA): variante protéica → fenótipos distintos • Polimorfismos de proteínas: • Grupos sanguíneos ABO e RH • Sistema de alfa1-antitripsina (1-AT): doença pulmonar, vários alelos (frequência de 10-75%) • Proteínas de destoxificação de xenobióticos: CYP, GST, NAT • Proteínas de reparo do DNA: XPD, XRCC1, XRCC2, XRCC3

  16. Polimorfismo em sequência não-codificadora (95% DNA):intergênica ou dentro de íntrons → sem consequência para o funcionamento do gene sem alterar proteínas ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS: 1:1000 pb

  17. TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS Minissatélite VNTR Microssatélite STR

  18. APLICAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENÉTICA MÉDICA: • Utilização como marcador genético: análise de ligação • Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas • Detecção de portador heterozigoto • Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete • Teste de paternidade e aplicações forenses • Tipagem tissular para transplante de órgão

  19. Alelos 1 e 2: diferentes polimorfismos alteram sítios de restrição • Alelo 1: sítio R (cortado pela enzima restrição) • Alelo 2: nucleotídeo X  perda R (sem corte) • Amplificação (PCR): • primers que flanqueiam o sítio de restrição • Digestão do produto de PCR com enzima R • Eletroforese: gel de agarose RFLP: Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição

  20. POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES (SSLP): - arranjos de sequências repetidas com variação no comprimento devido diferentes números de unidades repetidas (multi-alélicos). MINISSATÉLITES (VNTR):Número Variável de Repetições em Tandem -unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), • MICROSSATÉLITES (STR): Repetições em Tandem Curtas • unidades repetidas de 2-4 pb

  21. MINISSATÉLITES (VNTR):unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga. Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting) http://www.fathom.com/course/21701758/session1.html

  22. Formação de unidades repetitivas http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

  23. Vítima de abuso sexual: suspeitos 1 e 2 comparados com DNA do esperma encontrado na vítima Família com filhos biológicos e adotivos: Teste de Paternidade Filha D2: o pai é de casamento anterior Filho S2: adotado http://www.scq.ubc.ca/?p=250

  24. MICROSSATÉLITES (STR): • unidades repetidas de 2-4 pb: • CACA...CA; • CAACAA...CAA; • AAATAAAT...AAAT. • Existem 6,5x105 microssatélites no genoma humano. • Lócus de microssatélite é multi-alélico: cada pessoa deve ser heterozigota em mais de 70% • Espalhados por todo o genoma Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

  25. Diagnóstico de Doença Genética Doença Ligada ao X (recombinação=0)

  26. POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO – SNP: • Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por todo o genoma. • Aproximadamente 1:1350 pb no genoma • Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma • Polimorfismos com dois alelos • Aplicações: marcadores de mapeamento genético; antropologia molecular (evolução) e comparação entre diferentes populações (epidemiologia molecular) • Detecção: Chips de DNA (hibridização de nucleotídeos)

  27. REPARO DO DNA Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou induzidos por mutágenos • Reparo de pareamento errôneo • Reparo direto • Reparo de excisão de bases • Reparo de excisão de nucleotídeos • Reparo de quebras de fita dupla no DNA

  28. LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR Reparo do DNA Bloqueio do ciclo celular (Checkpoint) Danos DNA Apoptose Identifica lesão no DNA Proteína ATM Sinal p/ p53 → Ativar Genes Reparo DNA

  29. REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR - MMR Deslizamentos da DNA polimerase: regiões de microssatélite • reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb) • REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação • eliminação de bases mal pareadas e alças de deleção/inserção • atua na cadeia recém-sintetizada • genes MSH, MLH e PMS • Câncer de cólon não-poliposo familial: instabilidade de microssatélites • 70 a 85% de risco • mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns

  30. REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO Base errada 3’ 5’ Cadeia filha Cadeia parental G A MSH6   Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha G A MSH2 Excisão de fragmento de 100 a 1000pb contendo a base incorreta G MLH2 A PMS2 MSH3 Síntese de DNA e ligação da fita reparada DNA pol / A Fita reparada T A DNA ligase Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha

  31. REPARO DIRETO • reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificada • O6-metilguanina → transição G:C para A:T (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos) • Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase)→ remove o grupo metil • alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para cada lesão corrigida

  32. Agente alquilante O6-Metilguanina CH3 CH3 G C G C G C G C Reparo Direto Reconhecimento da base alterada e transferência do grupo metil para resíduo de cisteína da MGMT DNA restaurado e enzima inativa MGMT MGMT CH3 REPARO DIRETO

  33. REPAROS DE EXCISÃO ETAPAS COMUNS etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease) etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε) etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)

  34. REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER • reparo de danos causados por agentes endógenos (hidrólises, oxigênio reativo)  que modificam a estrutura das bases • reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alcilantes • realizado pelas DNA glicosilases quebram ligações base-açúcar  liberando as bases e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP)  reparado por endonucleases específica • cada DNA glicosilase reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise • Etapas: remoção da base danificada (DNA glicosilase) sítio AP  incisão do sítio AP (endonuclease)  excisão e remoção gerando lacuna  síntese DNA (DNA polimerase)  ligação da cadeia (DNA ligase)

  35. REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER Quebra de cadeia simples Base danificada * Reconhecimento e formação do sítio AP PARP XRCC1 DNA glicosilase Reconhecimento da quebra Reconhecimento e incisão 5’ do sítio AP APE1 PNK Incisão 5’   DNA pol FEN1 DNA pol Excisão da porção açúcar-P e síntese de DNA PCNA Síntese DNA e excisão XRCC1  DNA ligase III Ligação da cadeia XRCC1 DNA ligase I Ligação da cadeia Long-patch Short-patch 1 nucleotídeo 2-13 nucleotídeos

  36. REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER • remoção de adutos no DNA distorção da dupla hélice • dímeros de pirimidina, HAP, cisplatina • fatores ambientais • principal mecanismo de reparo • deficiência: doenças genéticas • realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG • remove 24-32 nucleotídeos

  37. Xeroderma Pigmentoso • Mutações em XPA-XPG •  1000 a 4000X o risco de câncer de pele  exposição solar ou irradiação UV

  38. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) TFIIH: complexo da RNA pol II com atividade de helicase XPG: endonuclease que corta a fita em 3’ ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’ DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova Ligase

  39. REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA • DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea induzida por radicais de O2 livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizante • causa de aberrações cromossômicas • Reparo homólogo (RH)  pareamento com o cromossomo homólogo intacto • Reparo de ligação das extremidades não- homologa (NHEJ)  religação direta das extremidades quebradas

  40. REPARO HOMÓLOGO Reparo DNA com fidelidade Radiação ionizante Quebra de cadeia dupla DNA ligase DNA pol Síntese de DNA e ligação das cadeias MRE11 Degradação 5’-3’ Rad50 NBS1 BRCA2 Rad52 Rad51 Invasão da cadeia BRCA1 Rad54 Cromátides irmãs

  41. Uma das fitas vermelhas apresenta uma quebra DNA polimerase desloca a fita d. Reparo posterior à duplicação por recombinação semelhante à conversão gênica ligação dos fragmentos heteroduplex duplicação posterior do DNA resulta em 3 alelos e 1 alelo Resultado final: um alelo verde foi convertido em um vermelho

  42. Agente danificante DNA fita dupla Quebra de cadeia dupla DNA PKc1 Processamento das extremidades DNA ligase IV Ligação das extremidades KU80 KU80 KU70 KU70 DNA reparado com baixa fidelidade XRCC4 LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS

  43. http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf

  44. Xeroderma Pigmentoso Síndrome de Cockaine Tricotiodistrofia Anemia de Fanconi Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA  freqüência  aberrações cromossômicas  incidência  câncer

  45. XERODERMA PIGMENTOSO (XP)  AR  Clínica manifestações cutâneas (1,5 anos) anomalias oculares (4 anos) anomalias neurológicas (6 meses) Xeroderma (pele seca) Incidência:1/250.000 (USA); 1/40.000 (Japão) Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x) XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)

  46. grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos  diagnóstico exposição a luz solar  tratamento proteção da pele da luz solar chapéus óculos que absorvem luz UV bloqueadores solares roupas protetoras acompanhamento periódico por dermatologista

  47. ANEMIA DE FANCONI (FA) AR Clínica anemia alterações da pigmentação da pele (64%) baixa estatura (62%) malformações do rádio (50%) anomalias oculares (41%), renais (34%), microcefalia (37%), deficiência mental (25%) 90% anemia aplástica

  48.  incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos • 8 grupos de complementação: FANCA a FANCG (heterogeneidade genética) • células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA: -mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ... • freqüência  de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos • quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multiradiais,

  49. figuras radiais endorreduplicação

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