CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

1. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Las fibras de celulosa del papel pueden actuar como fase estacionaria directamente, o ser un soporte para la adsorción de una fase estacionaria líquida, como el agua, por ejemplo. En el caso común, un extremo del papel se sumerge una pequeña distancia en la cámara cromatográfica que contiene a la fM. La mezcla en solución se depositó previamente en forma de una mancha en la línea de inicio. La mancha se debe aplicar lo más concentrada y pequeña posible, para evitar la dispersión prematura de la muestra por lo que normalmente se siembran manchas muy pequeñas, una sobre la otra, una vez que la anterior se haya secado por completo. La fM subirá por el papel por capilaridad. Se debe colocar la tapa de la cámara para asegurar que la atmósfera que rodee al papel esté saturada con el vapor de la fM.

3. Justo antes de que el frente del solvente llegue a la orilla superior del papel, se traza otra línea con lápiz, para marcar la distancia recorrida por la fM. A continuación se saca el papel y se deja secar. Luego ya se pueden calcular los valores de Rf(Factor deretención) para cada componente, como la relación de la distancia recorrida por la mancha entre la distancia recorrida por el frente del solvente desde la marca de inicio. Rf = dist recorrida por el analito/dist recorrida por el frente del solvente Debido a que los valores de Rf no son reproducibles con más de 2 cifras significativas, pues dicho valor presenta sensibilidad a variables tales como el grosor de la fE, la humedad que contiene la fM entre otros,

4. se recurre a otro valor que resulta más representativo, conocido como Factor de Retención RelativoRx, el cuál se define así: Rx = Dist recorrida por el analito/dist recorrida por una sustancia de referencia La sustancia de referencia es generalmente un patrón interno, el cuál se define como una sustancia de identidad conocida y con alta pureza que se emplea para fines de comparación. El Rx ideal es igual a 1, pues así se confirmaría la identidad de un analito con respecto de la sustancia de referencia.

5. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA: (Thin LayerChromatography, TLC) Conceptualmente es muy similar a la cromatografía en papel, pero permite hacer mejores separaciones y tiende a mostrar un comportamiento más reproducible. Para la TLC, se usa como fase estacionaria un sólido finamente dividido (inmovilizado sobre un vidrio, o sobre una hoja de material polimérico o una capa de aluminio), que puede ser alúmina (Al2O3), gel de sílice, entre otros. La fase móvil puede ser agua, solución acuosa de amoníaco o alguna otra mezcla, por ejemplo, una solución de alcohol/agua/ácido acético.

6. Las placas de TLC se marcan y se revelan en forma muy similar a la que se usa para la cromatografía en papel, pero teniendo el cuidado de trazar las líneas con el lápiz (con mina de grafito) en forma delicada para evitar que la fase estacionaria de la placa se fracture, y esto afecte la separación. Con frecuencia se recubre la fase estacionaria con un material fluorescente para ayudar a visualizar los componentes a medida que se separan, siempre que los compuestos en estudio posean electrones que al ser excitados emitan fluorescencia que se evidenciará al observarlos con luz ultra violeta. También se pueden usar reactivos reveladores nebulizados sobre las placas para hacer visibles a los analitos ya separados.

7. La forma de aplicar las muestras también es similar a la utilizada en cromatografía en papel, aplicando manchas pequeñas y secándolas antes de volver a aplicarlas para concentrarlas.

10. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (Estudiar la presentación del grupo de Edy Jiménes)

11. CROMATOGRAFÍA DE GASES En la cromatografía de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan como consecuencia de su distribución o reparto entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria sólida o líquida mantenida dentro de una columna. Para efectuar la separación en fase gaseosa, la muestra líquida se introduce en el inyector, en donde seconvierte en vapor, antes de pasar a la columna cromatográfica. La elución se consigue mediante el flujo constante de una fase móvil de gasinerte, conocido como gas portador,

12. O por su nombre en el idioma inglés: Carrier Gas. A diferencia de otros tipos de cromatografía, la fM no interacciona con las moléculas del analito, por lo cuál su única función consiste en transportar o acarrear al analito a lo largo de la columna. Se utilizan dos tipos de cromatografía gaseosa: a) Cromatografía de Gas-sólido (CGS) b) Cromatografía de Gas-líquido (CGL) En CGS la fM es un gas y la fE es un sólido que retiene a los analitos por adsorción física. Este tipo de cromatografía permite separar y determinar gases de bajo peso molecular, como los componentes del aire, sulfuro de hidrógeno (H2S), monóxido de carbono (CO) y óxidos de nitrógeno.

13. Sin embargo, esta variante de cromatografía ha tenido aplicación limitada debido a la retención semipermanente de moléculas activas o polares y a que a los picos de elución suelen presentar grandes “colas” como consecuencia de la naturaleza no lineal del proceso de elución. De manera que esta técnica no ha tenido una aplicación generalizada, salvo la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular, que ya han sido mencionadas. La Cromatografía de GAS-LÍQUIDO, se basa en la distribución o reparto del analito entre una fM gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar. En 1941 Martin y Synge propusieron por primera vez el concepto de la CGL. En 1955 apareció en el mercado el primer equipo comercial para CGL.

14. A partir de entonces, el crecimiento de la aplicación de esta técnica ha sido espectacular, pues desde su introducción comercial han ocurrido muchos cambios y mejoras en los instrumentos. En la década de 1970 se hicieron comunes los integradores electrónicos y los equipos de procesamiento de datos por computadora. En las décadas de 1980 y 1990 se introdujo el uso de computadoras para el control automático de los parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, las velocidades de flujo y la inyección de la muestra, también se desarrollaron instrumentos de alto rendimiento a costo moderado y lo más importante: el desarrollo de columnas tubulares abiertas que permiten la separación de los componentes de mezclas complejas en períodos de tiempo breves.

15. COMPONENTES BÁSICOS DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES Gas portador, Sistema de inyección de muestras, Configuraciones de Columnas y Hornos, Sistemas de detección

16. Gases Portadores Deben ser químicamente inertes y presentar alta pureza. los de uso más común son Nitrógeno, Helio e Hidrógeno. La elección de dicho gas está relacionada con el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se relacionan los reguladores de presión, los manómetros y los medidores de caudal. Además antes de la entrada del gas al instrumento, se le hace pasar por un tamiz molecular para eliminar la humedad y otras impurezas. El intervalo de presiones de entrada oscila comúnmente entre 10 y 50 psi. (sobre la presión circundante), lo que conduce a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas empacadas y de 1 a 25 mL/min en columnas tubulares abiertas. El caudal se puede medir con instrumentos electrónicos, o con el caudalímetro de pompas de jabón.

17. Y que se coloca al final de la columna roscada sólo por la parte superior al inyector cuando se efectúa la medición del caudal. Sistema de inyección de muestra: La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un tapón de vapor. La inyección lenta de muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de bandas y una resolución muy pobre. El método más sencillo de inyectar la muestra es hacerlo manualmente, con una microjeringa calibrada a través de un diafragma o septum de goma de silicona en el puerto de inyección

18. Generalmente el puerto de inyección se mantiene a una temperatura de unos 50C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. Los instrumentos más modernos están equipados con inyectores automáticos que para fines cuantitativos reducen notablemente el error experimental y permiten programar cantidades grandes de inyecciones y de muestras. El tamaño de la muestra varía desde menos de 1 L hasta 20 L para columnas empacadas, pero las columnas capilares exigen muestras mucho menores (~10­³L). Suele ser necesario emplear un inyector divisor de muestras (Split-split less) para las columnas capilares con el fin de introducir una fracción pequeña conocida (1:100 a 1:500) de la muestra inyectada, mientras el resto se desecha por el canal de purga.

22. Configuraciones de columnas y hornos Los tipos generales de columnas en CGL son las columnas empacadas o rellenas y las columnas tubulares abiertas (capilares y megaboro). En el pasado la mayor parte de análisis por CGL se efectuaban con columnas empacadas, pero en la mayoría de las aplicaciones actuales han sido sustituidas por las columnas tubulares abiertas. La longitud de las columnas cromatográficas varía desde menos de 2 hasta más de 50 metros. Se han fabricado de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida y teflón.

23. Corte transversal de columnas tubulares abiertas

24. Para lograr que las columnas encajen dentro del horno para su calentamiento, es habitual enrollarlas en serpentines con diámetros entre 10 y 30 cm. La temperatura de las columnas es una variable importante y para trabajar con precisión debe controlarse con una exactitud de décimas de grado. Generalmente una temperatura igual o un poco mayor que el punto de ebullición promedio de las muestras permite una duración razonable de análisis (2-30 min). En el caso de muestras con un intervalo de ebulliciónamplio, es necesario utilizaruna programación detemperaturas, con la que se incremente la temperatura de la columna de forma continua o escalonada, a medida que avanza la separación.

25. Ejemplo del efecto de la temperatura sobre los cromatogramas

26. Sistemas de detección Se han investigado y utilizado docenas de detectores durante el desarrollo de la CGL, por lo que se estudiarán aquellos de uso más frecuente y los más poderosos. Dado que el detector ideal debe poseer • Sensibilidad adecuada • Buena estabilidad y reproducibilidad • Respuesta lineal para los solutos extendida a varias órdenes de magnitud • Intervalo de temperaturas de ambiente hasta 400C • Tiempo de respuesta corto independiente del caudal • Alta confiabilidad y manejo sencillo • Respuesta semejante para todos los solutos • No destructivo de la muestra

27. Hasta la fecha, aún no se ha diseñado un detector que reúna todas las cualidades mencionadas, por lo que se mencionarán las características de los de uso más común: Detector de ionización de llama (FID) que es el que ha sido más ampliamente utilizado Detector de Captura de Electrones (ECD), específico para detectar y cuantificar compuestos halogenados Detector de Conductividad Térmica ó Catarómetro, que fue el primer detector utilizado, y Detector de Masas (MS) que por el momento es el más avanzado.