Partner 8 Dipartimento di Scienze Ambientali Università degli Studi di Parma

1. Partner 8Dipartimento di Scienze AmbientaliUniversità degli Studi di Parma LaRIA – Laboratorio Regionale per l’Innovazione nel controllo della qualità dell’Aria

2. Generalità della Sezione • La Sezione di Genetica e Biotecnologie Ambientali è coordinata dal Prof. Nelson MARMIROLI, attualmente Vice-Direttore del Dipartimento di Scienze Ambientali • Comprende un Professore Ordinario, due Professori Associati, quattro Ricercatori, un Tecnico • Al momento ospita un’assegnista, quattro dottorandi, due borsisti, tre contrattisti e alcuni tirocinanti e tesisti di lauree triennali e specialistiche

3. Principali attività di ricerca • Tracciabilità attraverso le filiere agroalimentari per la qualità e la sicurezza • Biotecnologie ambientali • Interazioni tra gli organismi viventi ed il loro ambiente • Controllo e ripristino della qualità ambientale

4. Composizione del gruppo • Elena Maestri (Prof. Associato) • Alessio Malcevschi (Ricercatore) • Giovanna Visioli (Ricercatore) • Marta Marmiroli (Ricercatore) • Andrea Pirondini (Dottorando) • Un borsista da assumere

5. Contributi previsti • Sottoprogetto 1 • OR1, 43 giorni uomo • OR2, 51 giorni uomo • OR4, 92 giorni uomo • OR7, 120 giorni uomo

6. Approccio generale • L’unità di ricerca propone approcci di bioindicazione e biomonitoraggio attivi, in cui piante superiori appositamente scelte in base alle loro caratteristiche verranno esposte in modo controllato a particolari condizioni di inquinamento atmosferico, e analizzate al termine del periodo di esposizione per ricavarne informazioni utili sul tipo e sul grado dell’inquinamento. • Inoltre, l’Unità svilupperà strategie per il monitoraggio qualitativo di metalli pesanti mediante la rilevazione in tessuti umani prelevati da lavoratori professionalmente esposti e valuterà la frequenza, entro le categorie esposte, di individui ipersensibili a patologie dell’apparato respiratorio mediante l’analisi di marcatori ecogenetici.

7. OR1, Sviluppo di sensori a stato solido basati su ossidi semiconduttori nanostrutturati per la rilevazione CO, NOx,O3, SO2, NH3 e VOC e di strategie innovative di monitoraggio tramite biosensori • Conoscenze pregresse • I contaminanti aerei raggiungono la superficie delle piante per deposizione umida o occulta, deposizione gassosa a secco o deposizione di particolato a secco. L’importanza relativa dei diversi eventi dipende dal tipo di emissione, dalle proprietà fisico-chimiche dei contaminanti, dalle condizioni atmosferiche e climatiche, dalla struttura e dalla suscettibilità delle piante. Per i contaminanti volatili predomina la deposizione gassosa. • L’ingresso di VOC e SVOC nei tessuti vegetali richiede deposizione e cattura alla superficie esposta delle piante. Il pathway di assunzione dipende dalle caratteristiche chimiche della sostanza e da caratteristiche della pianta, ma l’effettivo ingresso nei tessuti è modulato da fattori ambientali. • La concentrazione delle sostanze volatili nella pianta raggiunge velocemente un equilibrio con la loro concentrazione nell’atmosfera, e questo rende le piante ottime indicatici del carico inquinante a breve termine nel corso del campionamento. Per le sostanze semivolatili si può considerare invece un fenomeno di accumulo e quindi di integrazione temporale delle concentrazioni nel corso di esposizioni prolungate.

8. Attività proposte • Si svolgeranno ricerche bibliografiche per definire le caratteristiche dei sensori biologici ideali per il lavoro proposto nei successivi OR; una volta identificate le piante che da esperienze precedenti o da dati riportati si riterranno più opportune, si procederà con limitati esperimenti di laboratorio per implementare le tecniche di coltivazione ed esposizione da utilizzare successivamente. • Indicazioni già acquisite suggeriscono l’utilizzo di: • Piante accumulatrici di xenobiotici organici: Brassica oleracea cv. acephala; Lolium multiflorum, Taraxacum officinale. • Piante modello per studi di genotossicità: Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia. • Piante per indagini proteomiche: Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia

9. Biomonitoraggio • Il gruppo ha già svolto in passato esperienze di biomonitoraggio con piante superiori. In particolare, una lunga collaborazione con l’azienda AMNU e la sezione ARPA di Parma ha riguardato il monitoraggio della zona circostante l’inceneritore di rifiuti, ora dismesso, e zone a diverso livello di traffico nella rete urbana della città di Parma. • Il Comune di Santo Stefano Magra (SP) ha deciso di monitorare l’inquinamento nel trafficatissimo incrocio tra il raccordo autostradale e la statale della Cisa non per mezzo delle tradizionali centraline, bensì affidandosi alle piante. L’iniziativa, denominata “Pianta Mia”, si avvale della collaborazione dell’Università di Parma e ha previsto la messa a dimora, in una grande aiuola, alle porte del paese, di piante di cavolo ornamentale, bosso, aucuba, erica, iperico, cineraria, ginepro, evonimo e Cotoneaster. Nella scelta delle essenze ci siamo basati su precedenti studi.

10. OR2, Sviluppo di sistemi per la rilevazione di gas inquinanti in ambienti outdoor • Conoscenze pregresse • Le piante devono essere esposte all’inquinamento atmosferico con le loro parti aeree, in siti dove l’aria possa circolare liberamente senza ostacoli, idealmente nella stessa posizione delle centraline di rilevamento di parametri fisico-chimici. La posizione deve essere elevata per impedire l’accesso volontario o accidentale di persone o animali terrestri, e sarà necessaria una protezione contro gli uccelli. Per evitare effetti di dilavamento da parte delle precipitazioni il biosensore sarà coperto da una tettoia e il terreno dei vasi sarà adeguatamente rifornito di acqua mediante annaffiatura dal basso. Le piante per la captazione delle sostanze gassose saranno esposte all’aria in sistemi chiusi protetti da filtri atti a fermare il particolato atmosferico (cellulosa). • Per motivi di uniformità, le piante da usare come biosensori dovranno essere, entro specie, geneticamente uniformi (anche se non omozigoti), allevate a partire da seme o talea in condizioni simili e tutte con la stessa età, evitando esemplari evidentemente anomali o malati.

11. Attività proposte • Le attività saranno rivolte alla scelta e coltivazione delle piante da utilizzare come biosensori in numero sufficiente alla preparazione dei necessari sistemi di monitoraggio: Brassica oleracea cv acephala coltivata da seme, Lolium multiflorum, Taraxacum officinale, Arabidopsis thaliana, o altre identificate nell’OR1 • Scelta dei siti da sottoporre a monitoraggio e delle sostanze da analizzare in accordo con altre Unità • Progettazione dei biosensori e loro preparazione • Definizione delle metodologie per • Analisi chimica e identificazione delle sostanze organiche presenti in campioni vegetali (IPA in foglie di Brassica oleracea cv acephala dopo 8 settimane di esposizione) • Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante modello (in situ ed ex situ): Arabidopsis • Analisi proteomiche in Arabidopsis • Analisi statistica dei risultati

13. esposizione Estrazione DNA Amplificazione PCR (RAPD) elettroforesi analisi

14. Analisi di polimorfismi • La valutazione della frequenza di mutazioni insorte nel corso dell’esposizione ai contaminanti si effettuerà calcolando il numero di polimorfismi evidenziabili all’interno della popolazione esposta in confronto al numero di polimorfismi evidenziabili in popolazioni di controllo mantenute in ambienti controllati (camera di crescita) senza alcuna esposizione. L’ipotesi di lavoro è che nelle popolazioni non esposte insorgano poche o nessuna mutazione, e che nelle popolazioni esposte ne insorgano con maggiore frequenza, portando quindi a un numero di polimorfismi maggiore nelle popolazioni esposte. • L’identificazione di polimorfismi si effettuerà con le tecniche basate sui marcatori molecolari di tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), tecniche che analizzano simultaneamente decine di siti genomici grazie all’amplificazione mediante PCR di frammenti a partire da inneschi molecolari di sequenza definita e arbitraria (Conte et al. 1998, Chemosphere 37:2739-2749). • Variazioni nel numero e nella lunghezza dei frammenti amplificati in individui diversi identificano i polimorfismi e sono indice di mutazioni avvenute nella popolazione esposta. Il numero di polimorfismi è correlabile alla durata dell’esposizione per cercare una stima quantitativa della relazione tra esposizione ed effetto.

15. * * * * * * * * * Esempi di gel * * * * Diverse combinazioni di marcatori molecolari saggiate su piantine di Arabidopsis ottenute da semi esposti a mutagenesi con elevate concentrazion di metalli pesanti: Cd, Pb, Mn. Il grafico mostra i numeri relativi di prodotti di amplificazione che erano esclusivamente presenti negli individui trattati con Cd in confronto con i prodotti esclusivamente presenti nei controlli non trattati o comuni a entrambi

16. Analisi proteomiche • Estratto proteico • Separazione delle proteine (gel bidimensionali, cromatografia liquida) e individuazione di eventuali differenze tra diversi estratti • Isolamento di questi “spot” e analisi ulteriore attraverso spettrometria di massa • Individuazione della proteina attraverso appositi database informatici

17. CROMATOGRAFIA LIQUIDA 2-D “ProteomeLab PF-2D” • Consiste in una doppia colonna cromatografica • La prima colonna separa il campione secondo il punto isolettrico “High-performance chromatofocusing (HPCF)”. • Le frazioni cosi’ ottenute vengono raccolte e iniettate all’interno della seconda colonna cromatografica che ci permette di separare le proteine secondo la loro polarita’ “high-resolution reversed-phase chromatography (HPRP)” .

18. DeltaVue è un software che serve per confrontare le frazioni ottenute ed evidenziare eventuali differenze qualitative e quantitative 2-D differential map of selected pH fractions (pH range 6,17-6,47)

19. OR4, Prove in campo con i prototipi dei sistemi sviluppati nei precedenti OR • Le attività saranno rivolte a: • Installazione e mantenimento dei biosensori • Campionamento periodico • Analisi chimica e identificazione delle sostanze organiche presenti in campioni vegetali: IPA in foglie di Brassica oleracea cv acephala dopo 8 settimane di esposizione • Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante modello (in situ ed ex situ): Arabidopsis • Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis • Analisi statistica dei risultati • Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da altre Unità

20. OR7, Biomonitoraggio di particolato atmosferico (APM) in piante superiori e gruppi di lavoratori professionalmente esposti • Conoscenze pregresse - piante • Per i contaminanti non volatili e i metalli pesanti predomina la deposizione come particolato sia umida che a secco. Solo pochi elementi chimici possono essere assunti a livello delle foglie, quali carbonio, ossigeno, azoto, fluoro, zolfo. Altri elementi possono però essere adsorbiti dalla superficie fogliare ed essere evidenziabili analizzando le superfici non lavate. Il pathway di assunzione dipende dalle caratteristiche chimiche della sostanza e da caratteristiche della pianta, ma l’effettivo ingresso nei tessuti è modulato da fattori ambientali. I contaminanti legati alle particelle, come metalli pesanti e composti organici non volatili, si depositano sulla superficie e possono essere adsorbiti alla cuticola, inglobati in essa oppure addirittura assunti tramite essa. Lo strato ceroso agisce come accumulatore di inquinanti particolati. • Si è dimostrato che nella cuticola si accumulano elementi che comprendono Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, e che questi non possono essere dilavati facilmente delle precipitazioni. Elementi quali Mg, K, Ca, Cd e Zn non si legano invece significativamente alla cuticola. Tutti questi elementi possono comunque essere distribuiti ad altre parti della pianta. • L’apporto di composti organici da parte del particolato è significativo solo per molecole con coefficienti di ripartizione ottanolo/aria superiori a 11, quali diossine e furani, e composti policiclici aromatici con più di 5 anelli.

21. Attività previste (sovrapposizioni con OR4) • Scelta dei siti • Scelta e coltivazione delle piante • Installazione e mantenimento dei biosensori • Campionamento periodico • Analisi chimica e identificazione delle sostanze organiche presenti in campioni vegetali • Analisi SEM/EDX del particolato presente sui campioni di foglie: Lolium e Taraxacum e altre specie • Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante modello (in situ ed ex situ): Arabidopsis • Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis • Analisi statistica dei risultati • Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da altre Unità

22. Analisi chimiche • Le analisi chimiche (ICP-OES) e spettroscopiche (SEM/EDX) sono state applicate negli ultimi 7 anni a diverse piante in diversi contesti: • Piante di interesse agricolo per valutare il flusso di metalli pesanti nelle parti commestibili • Piante iperaccumulatrici di nichel da siti naturalmente contaminati per rilevare i siti di accumulo e le differenze con congeneri non accumulatori • Piante arboree sottoposte a trattamento con piombo per identificare i siti di accumulo nella radice • Piante modello geneticamente modificate per evidenziare il trasporto di cesio • Piante acquatiche in celle di trattamento per reflui caseari per evidenziare l’accumulo di contaminanti inorganici e nutrienti

23. Alyssum

24. Phragmites

25. Juglans

26. OR7, Biomonitoraggio di particolato atmosferico (APM) in piante superiori e gruppi di lavoratori professionalmente esposti • Conoscenze pregresse – ipersensibilità • Il particolato atmosferico è ritenuto responsabile della maggior parte degli effetti avversi sulla salute umana provocati dall’inquinamento atmosferico. Un’esposizione ad alti livelli e prolungata nel tempo aumenta i rischi di cancro, malattie respiratorie, arteriosclerosi, mentre le brevi esposizioni esacerbano bronchiti e asma. Gli effetti si correlano alla presenza di IPA, metalli di transizione, benzene. Una valutazione dell’esposizione a livello dei singoli individui della popolazione sarebbe un primo passo per stabilire relazioni tra causa ed effetto nelle patologie provocate dall’inquinamento. La valutazione dell’esposizione individuale può essere eseguita misurando un “biomarcatore” meccanicisticamente correlato, che sia sensibile e specifico. Ad esempio, il metabolita 1-idrossipirene (1-HP) nelle urine è considerato un biomarcatore di esposizione a IPA. • Per quanto riguarda l’esposizione a metalli pesanti, l’analisi degli elementi nei capelli è considerata una buona fonte di informazione. I capelli riflettono la presenza di metalli e altri elementi nel sangue e sono considerati utili specialmente per individui professionalmente esposti. Anche altri peli corporei possono essere usati per lo stesso scopo. • Un importante gruppo di contaminanti del particolato sono gli IPA, ad effetto cancerogeno, e la loro attività mutagena dipende spesso dalla attivazione metabolica ad opera di enzimi, in particolare citocromi P450 monossigenasi della famiglia CYP1A1. Perciò si considera che variazioni nei livelli individuali di attività enzimatica CYP1A1 possano essere correlate con variazioni nella sensibilità individuale ai danni prodotti da questi composti. Valutare i polimorfismi genetici per questo gene (di cui sono noti 9 alleli), e quindi la frequenza di questo marcatore ecogenetico, consente di stimare l’esistenza di individui ipersensibili nella popolazione. La presenza di individui ipersensibili nelle categorie di lavoratori professionalmente esposti all’inquinamento atmosferico è quindi un ulteriore fattore di rischio occupazionale, che dovrebbe essere conosciuto per meglio prevenire l’insorgenza di malattie gravi.

27. Attività proposte • Gruppi di lavoratori professionalmente esposti: autisti di mezzi pubblici, addetti alla distribuzione della posta, vigili urbani. Controllo: colleghi che lavorano in ufficio (non esposti) con simile distribuzione per sesso, età, abitudini relative al fumo. • Scelta dei gruppi da sottoporre a monitoraggio per marcatori ecogenetici di suscettibilità, per metabolici di IPA nelle urine e per il contenuto di metalli pesanti nei capelli. Ottenimento delle autorizzazioni e dei consensi. • Analisi delle abitudini di vita e lavorative, costituzione dei gruppi esposti e di controllo, identificazione dei periodi di esposizione. • Campionamento periodico • Analisi chimica di idrossipirene nelle urine • Analisi SEM/EDX di campioni di capelli • Analisi di polimorfismi in marcatori ecogenetici: CYP1A1 (metabolismo degli IPA), CYP2E1 (metabolismo del benzene), NQO1 (detossificazione di chinoni), GSTM1 e GSTT1 (inattivazione per coniugazione). • Analisi statistica dei risultati • Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da altre Unità

28. Analisi di marcatori ecogenetici • A causa della diversità genetica tra individui, gli appartenenti a popolazioni umane diverse sono diversamente suscettibili agli agenti inquinanti, e più o meno predisposti allo sviluppo di sintomatologie patologiche • L’identificazione di questi fattori genetici polimorfici, attuabile attraverso tecniche biotecnologiche, è molto importante per comprendere il fenomeno che chiamiamo “ipersuscettibilità individuale” • Esempio • L’enzima alfa1-antitripsina del siero è un fattore di suscettibilità • Infatti, la carenza di questo enzima sarebbe connessa allo sviluppo di patologie broncopolmonari (enfisema) e del fegato • Il rischio è ulteriormente aumentato da particolari abitudini di vita, come il fumo • Quindi, un individuo carente per questo enzima, se esposto all’inquinamento atmosferico, ha una maggiore probabilità di ammalarsi rispetto ad altri individui. Se inoltre fosse un fumatore, il rischio sarebbe ancora maggiore.

29. Esperienza del gruppo • Il gruppo ha una lunga esperienza nell’analisi di marcatori genetico-molecolari in organismi diversi. Di recente, il laboratorio si è dotato di sofisticate strumentazioni per l’analisi genetica che faciliteranno questa parte del lavoro (sequenziatore automatico di acidi nucleici, RealTime PCR). • Per quanto riguarda l’analisi di elementi chimici quali i metalli pesanti in tessuti, da diversi anni il gruppo proponente ha applicato tecniche di microanalisi a scansione e microfluorescenza alla descrizione qualitativa e quantitativa della localizzazione tissutale di Pb, Ni, Cu, Zn, Cs ed altri elementi in diverse specie vegetali. Tale esperienza è facilmente estendibile a tessuti di provenienza umana. • Contatti con colleghi dell’area medica sono già stati intrapresi.