Espectrometría de masas molecular.

1. Espectrometría de masas molecular.

2. Antecedentes de la espectrometría de masas La espectrometría de masas es la de mayor aplicación, en el sentido de que esta técnica es capaz de proporcionar información acerca: • Composición elemental de las muestras • Estructura de las molecular orgánicas, inorgánicas y biológicas. • Composición cualitativas como cuantitativas de mezclas complejas • Estructura y composición de superficies sólidas • Relaciones Isotópicas Electrospray (nanoSpray) Ion Source in LTQ-FTICR mass spectrometer

3. La primera aplicación general de E.M en análisis químico se produjo a principios de los 40´s, cuando esta técnica se comenzó a usar para el análisis cuantitativo en mezclas de hidrocarburos, antes este tipo de análisis se llevaba por destilación fraccionada y posteriores medidas de ind. De refracción. Para completar este tipo de análisis se llevaban aprox. 200hrs o mas. Sin embargo con el E.M. esta información se obtiene en algunas horas o menos. En los 80´s las aplicaciones del E.M experimento grandes cambios en consecuencia del desarrollo de métodos de producción de iones de moléculas no volátiles. Actualmente esta técnica es aplicada en determinación de estructuras de polipéptidos, proteínas y otros biopolímeros de gran PM.

4. *Analito: etilbenceno *Masa molecular:10^6 daltons *Bombardea con haz de electrones para dar la formación de un ión molecular como se muestra en la reacción: C6H5CH2CH3 + e  C6H5CH2CH3(+) + 2e

5. El ión molecular es un ión radical y tiene el mismo PM que la molécula. La colisión entre los electrones y las moléculas del analito, proporciona suficiente energía para dejarlas en estado excitado, posteriormente se produce la relajación, con frecuencia mediante la fragmentación de los iones moleculares, que dan iones de masas bajas, por ejemplo en el etilbenceno el producto mayor es: C6H5CH2(+) y aparte CH3. Los iones positivos producidos por el impacto de electrones pasan a través de la rendija del E.M, de donde salen en relación a su masa y su carga (m/z) Al pico mas alto se le denomina pico base y se le asigna el valor 100 de forma arbitraria, se considera la altura del resto de los picos como porcentaje de la altura del pico base.

6. Fuente de Iones En la E.M. la formación de iones del analito en forma gaseosa y la proyección y utilidad del mismo, esta condicionada por el proceso de ionización.

7. Fase gaseosa: primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza. Esta está restringida a compuestos térmicamente estables que tengan punto de ebullición menores de 500ºC aprox., esto limita a compuestos de pesos moleculares aproximadamente 10^3 daltons. Fuentes de desorción: La muestra en estado liquido o sólido se transforma directamente en iones gaseosos. La ventaja de esta es que son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables. Aplicable a compuestos con PM de 10^5 daltons. Métodos separados en 2 categorías

8. Las fuentes de iones se clasifican: Fuentes duras: comunican la energía suficiente a las moléculas de manera que se encuentran en un estado de alta excitación, cuando se relajan se producen iones fragmentados con una relación de masa carga menor que el ión molecular. Nos proporciona información de la naturaleza de los grupos funcionales, así como información estructural de los analitos. Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación, así que el E.M. consta de un pico y solo alguno o ningún otro pico. Nos permite la determinación exacta del PM de la molécula o moléculas

9. Diferencia en E.M de fuente dura y blanda

10. Fuente de Impacto de Electrones

11. E.M de impacto de electrones Con objeto de formar un numero significativo de iones gaseosos en una proporción reproducible, es necesario que los electrones generados por el filamento sean acelerados mediante un potencial mayor de unos 50V, esto logra hacer que se excite las moléculas, la subsecuente relajación tiene lugar a una elevada fragmentación, que da iones de mas baja masa que la del ión molecular, a estos se les llama iones hijos.

12. Los complejos E.M que se obtienen con ionización por impacto de electrones son útiles para la identificación de compuestos, por otra parte para cierto tipo de moléculas la fragmentación es tan efectiva que no queda ningún ión molecular, por tanto la información para la determinación del PM se pierde.

14. Picos de los Isótopos En los EM a veces aparecen picos que corresponden a masas mayores que la del ión molecular, estos picos se atribuyen a iones que tienen la misma formula química pero deferente composición isotópica

15. Picos resultantes de las colisiones Las colisiones ión-molécula: pueden producir picos que corresponden a masas mas elevadas que la del ión molecular, sin embargo a presiones normales de la muestra, la única reacción de este tipo que ocurre es la que por medio de colisiones se transfiere un átomo de hidrógeno al ión para dar un ión molecular protonado, el resultado es un pico intenso, la altura de este pico aumenta si aumentamos la presión, así que la detección de esta reacción es posible

16. Ventajas e Inconvenientes de las fuentes de impacto de electrones Ventajas: Las fuentes de impacto de electrones son adecuadas para el uso y producción de corrientes de iones elevadas, obteniéndose buenas sensibilidades. La extensa fragmentación y el elevado numero de picos nos permite la identificación inequívoca de posibles analitos Desventajas: Puede dar la desaparición del ión molecular y esto nos impide establecer el PM del analito. Necesidad de volatilizar las muestras, por que se puede dar la degradación térmica de las muestras

17. Ionización química. • Producida por el choque con iones de gas reactivo bombardeado. • Casi siempre iones +. • 2º más utilizado.

18. Modificaciones en zona de ionización. • Relación de concentración reactivo – muestra 103 a 104.

19. Reactivos. • Metano, (más común). • Sus colisiones generan. • Propano. • Isobutano. • Amoniáco.

20. Ventajas ionización química. • Impacto de electrones. • Ionización química.

21. Ionización por campo. • Campo eléctrico elevado (10^8 V/cm). • Emisores wolframio (agujas). • Efecto túnel (mecánica cuántica). • Poca fragmentación.

22. Espectro de ionización por campo. • Ionización por campo. • Impacto de electrones.

23. Fuentes de desorción. • Muestras: • No volátiles. • Térmicamente inestables. • No requiere volatilización. • Espectro muy simple.

24. Desorción por campo. • Emisor con múltiples puntas. • Sonda recubierta con muestra. • Potencial elevado (puede haber degradación).

25. Desorcíon/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI). • Descrito en 1988. • Sustancia matriz absorbe radiación. • Láser pulsante sublima analito. • Espectro de tiempo de vuelo. • No hay fragmentación.

26. Sustancias matrices.

27. Ionización por electronebulización. • Descrita 1984. • Análisis biomoléculas. • Condiciones atmosféricas.

28. Otros métodos desorción. • Bombardeo con átomos rápidos. • Por plasma. • Iones secundarios. • Termonebulización.

29. Componentes del instrumento.

30. Sistemas de entrada de la muestra Introducción de una muestra representativa en la fuente de iones. Tipos de entrada: • Sistemas indirectos de entrada • Entrada por sonda directa • Entradas cromatográficas • Entrada de electroforesis capilar

31. Sistemas indirectos de entrada Es el más simple La muestra se volatiliza externamente entra a través de un diafragma de metal o vidrio con varios orificios en la región de ionización (baja presión) Muestras: Punto de ebullición 500° C • Gaseosas: se recoge el gas entre dos válvulas en el área de medida que después se expande en el contenedor • Líquidos: se introduce en un depósito una cantidad pequeña de la muestra. (P: 10-5 a 10-4 torr) Punto de ebullición 150° C se usa un horno y cintas calefactoras para mantener la T elevada. El sistema de entrada es de vidrio para evitar pérdidas de analitos polares por adsorción.

32. Entrada por sonda directa • Para introducir líquidos o sólidos no volátiles, se utiliza sonda que se inserta a través de un cierre de vacío. • Cuando la cantidad de muestra es limitada, se pierde menos muestra • Se coloca generalmente en la superficie de un vidrio o tubo capilar de aluminio. • Esta a pocos mm de la fuente de ionización, es posible obtención de espectros de compuestos térmicamente inestables. • La sonda permite el estudio de materiales no volátiles

33. Sistemas de entrada cromatográficos y de electroforesis capilar • Espectrómetro de masas acoplado a CG, HPLC o columnas de electroforesis capilar, que permiten la separación y determinación compuestos de mezclas.

34. Analizadores de masas Separación de iones con diferente relación m/z • Sensible a diferencias muy pequeñas de masa • Permiten el paso un número de iones suficiente para producir corrientes iónicas fáciles de medir Resolución Capacidad del instrumento de distinguir entre masas: R = m / Δm Donde Δm= diferencia de masa entre dos picos adyacentes resueltos m= masa nominal del primer pico Dos picos están separados si la altura del valle entre ellos no es mayor de una determinada fracción de su altura (10%)

35. C2H4+ PM: 28,01313 CH2N+ PM: 28,0187 N3+ PM: 28,0061 CO+ PM: 27,9949 Resolución de varios miles NH3+ PM: 17 CH4+ PM: 16 R < 50

36. Tipos de analizadores Analizadores de sector magnético o espectrómetros de enfoque simple Utilizan un imán permanente o electroimán El haz procedente de la fuente de iones se desplaza (trayectoria circular 180, 90 o 60°.

37. Los iones son acelerado a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico (P = 10-7 torr). Se puede hacer un barrido de los iones de diferente masa variando la fuerza del campo del imán o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B. Estos iones pasan a través de la rendija de salida se recogen en un electrodo colector, dando lugar a una corriente de iones. Se amplifica y se registra R≤ 2,000 Los iones de la misma carga poseen la misma energía cinética, después de la aceleración independientemente de su masa Los iones que abandonan la rendija tienen la misma energía cinética . Los iones más pesados se desplazan con velocidades menores.

38. Espetrómetros de doble enfoque Combinación de campo magnético y electrostático R = 10 5

39. Espectrómetro de masas cuadrupolar Tiempos de barrido pequeños Útil para realizar barridos de picos cromatográficos en tiempo real

40. Analizador de masas de tiempo de vuelo Fácil acceso a la fuente de iones Ilimitado intervalo de masas Resolución y sensibilidad limitada

41. Analizadores de trampa de iones • Cationes o aniones gaseosos pueden confinarse largos periodos de tiempo • Campo magnético o eléctrico

42. Instrumentos de transformada de Fourier (FT) • Mejor relación señal/ruido • Velocidades mayores • Sensibilidad y resolución elevadas • Aprovecha el fenómeno de resonancia iónica ciclotrónica

44. Espectrómetros de masas computarizados • Software interactivo y fácil de utilizar

45. Aplicaciones de la espectrometría de masas molecular. • Las aplicaciones de la espectrometría de masas son muy numerosas y abarcan demasiados campos.

46. Identificación de compuestos puros. • El espectro de un compuesto puro proporciona diversos tipos de datos que son útiles para su identificación. • Peso molecular del compuesto. • Fórmula molecular. • Además el estudio de los modelos de fragmentación que se pone de manifiesto en el espectro de masas, proporciona información sobre la presencia/ausencia de diversos grupos funcionales. • La identidad de un compuesto se puede establecer mediante la comparación de sus espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta llegar a total coincidencia.

47. Determinación de los pesos moleculares a partir de los espectros de las masas. • Por aquellos compuestos que pueden ionizarse por alguno de los métodos anteriormente descritos, dando un ion molecular o un ion molecular protonado o desprotonado. • El espectrómetro de masas es una herramienta insuperable para la determinación del peso molecular, esta determinación requiere la identificación del pico (M+1)+ o (M-1)+. La localización del pico en la abscisa da el peso molecular una precisión que no se puede alcanzar por ningún otro método.

48. Una determinación por espectrometría de masas requiere conocer con certeza la identidad del pico del ion molecular. • Es aconsejable ser precavido, en particular con las fuentes de impacto de electrones, donde el pico del ion molecular puede estar ausente o ser pequeño en relación con los picos debidos a las impurezas. • Cuando existen dudas son particularmente útiles los espectros adicionales de ionización química, de ionización por campo y de ionización por desorción.

49. Formulas moleculares a partir de pesos moleculares exactos. • Las fórmulas moleculares se pueden determinar a partir del espectrómetro de masas de un compuesto, siempre que el pico del ion molecular pueda ser determinado y su masa exacta determinada; sin embargo, esta aplicación requiere un instrumento de alta resolución. • Ejemplo. • Si la masa medida del pico del ion molecular es 120.070 (±0,005),