Mikotoksini

1. Mikotoksini Mirjana Đukić mirjana.djukic@parmacy.bg.ac.rs 16. mart 2012.

2. Mikotoksini • Mykos(buđ – plesan) • Toxicum (lat. - otrov) • Istraživanje mikotoksina datira 100 godina unazad (1891, Japan: Sakaki je pokazao da je neglazirani, budjav pirinač fatalan za eksperimentalne životinje (zečevi i pacovi), target organ: CNS (paraliza- bolest Shoshin-kakke, uzročnik trovanja: Penicillium commune (objavljeno prvi put 1920, Prof. I. Miyake i Dr. Takada ) • Miyake (Japan) je prvi put iz “žutog pirinča” ( Japanskog i Tajvanskog) izolovao P. citreonigrum (=P. toxicarium), plesan koja produkuje visoko toksičan citreoviridin. • Najtoksičnije mikotoksine produkuju Penicillum vrste: • Penicillum citrinum - žuti pirinač, “sindrom žutog pirinča”, “kardijalni beri-beri”, proizvodi: citrinin; (kancerogeno i nefrotoksično dejstvo); • Penicillum islandicum – braon pirinač, proizvodi: luteoskirin i ciklohloritin; (kancerogeno i hepatotoksično dejstvo) Publikacija: Yakushigaku Z, Udagawa S, Tatsuno T..Safety of rice grains and mycotoxins - a historical review of yellow rice mycotoxicoses. Article in Japanese. 2004;39(2):321-42. • Poslenjih40 godina (SAD: $5 miliona se troši na sve aspekte mikotoksina)

3. Usevi (žitarice, pirinač) su često kontaminirani gljivama koje tokom metaboličkih porcesa stvaraju toksične produkte (toksične plesni) “mikotoksine”. • U grupi mikotoksina, Aflatoksini su najtoksičniji u grupi mikotoksina (250 različitih plesni produkuje više od 100 mikotoksina različite hemijske strukture i različite toksičnosti...) Mikotoksikoze: trovanja mikotoksinima kod ljudi i toplokrvnih životinja. • Vrste trovanja prema uzroku: • Slučajna, ali i zločinačka • Vrste trovanja prema dužini per os ekspozicije: • akutna i hronična • Ciljni organi: • CNS, KV, respiratoni sistem, GIT (smrt) • Neki sukarcinogeni (Aflatoxin B –jedan od najjačih hepatokarcinogena), mutageni, teratogeni i imunosupresivi

4. Podela mikotoksina prema hemijskoj strukturi 3-nitropropionska kiselina Aflatoksini Fumonizini Ohratoksni Trihoteceni Zearalenon Prema: Hemijskoj strukturi Poreklu (izvoru): vrsta gljiva koje ih produkuje (jedna vrsta gljiva moža da produkuje više mikotoksina... njihovoj biosintezi (produkti određenih metaboličkih procesa u gljivama); Podela mikotoksina

5. 3-nitropropionska kiselina (1/2) • Izvor: • Aspergillus • Penicillium • Arthrinium • Mehanizam dejstva: • Mitohondrijalniotrov • Supstrat za enzim sukcinat dehidrogenazu (kompeks II u mitohondrjalnom respiratornom lancu - prevodi sukcinat u fumarat. (nije kometitivni inhibitor). • Klinička slika trovanja: • simptomi slični Huntington-ovoj bolesti • Metabolizam: • Posle resorpcije iz GIT ulazi u cirkulaciju i metaboliše se do nitrita, a delimično se oksidiše u prisustvu sukcinat dehidrogenaze.

6. 3-nitropropionska kiselina (2/2) • Retka su trovanja kod ljudi • Ne akumulira se u organizmu, male doze ne dovode do ireverzibilnih promena • LD50 miš 60-120 mg/kg. • Nema mutagena niti karcinogena svojstva, • ne dovodi do hroničnog trovanja. • NOAEL pacovi 2.5-3.75 mg/kg/dan • ADI ljudi (70 kg) 25 μg/kg/dan tj. 1.750 mg/dan

7. Aflatoksini (1/6) Aflatoksin B1 • najtoksičiji i uvek prisutni gde su i B2, G1 i G2 Aflatoksin B2 Aflatoksin G1 Aflatoksin G2 Aflatoksin M1 • u mleku • metabolički produkt Aflatoksina B1 ... (ima ih više od 10) • Izvor: Aspergillus flavus Aspergillus Parasiticus Aspergillus homius • Rasprostranjenost: • kikirikiju, pistaćima, lešnicima, semenu pamka, susamu, kukuruzu, soji • Kod nedovoljno osušene hrane (pre i pose žetve, puno kiša, raspadanje insekata), u subtropskim i tropskim krajevima

8. Aflatoksini (2/6) • Kumarinski derivati • Fluoresciraju...(na osnovu boje fluorescencije pod UV zracima-B “blue” i G “green”) • Obeležavanje: • Velikim slovima na osnovu fluorescencije ili prisustva u određenim namirnicama; npr. M prisutni u mleku... • Aflatoksin B – difurokumarociklopentenoni; • Aflatoksin G – difurokumaroli;

9. Metabolizam Aflatoksina B1 • u organizmu se metabolišu u toksičnije metabolite, epoksidne strukture, koji su nosioci karcinogenog efekta!

10. Aflatoksini (4/6) • Karcinogeni • Aflatoksin B - gupa 1 (rak jetre i supresija imunog sistema) • Aflatoksini G1 i M, potvrđen kod životinja. • Imunosupresivi • primena vakcina kod životinja ne daje adekvatan odgovor • Akutna toksičnost: • Pernata živina: • 'Turkey X' u UK, ranih 1960ih, (na hiljde uginulih ćurki, pataka) • Ljudi: • Anon, 1993; Indija, 1974; Kenija, 1982 (obilne nesezonske kiše- aflatoksinom kontaminiran kukuruz). • Hronična trovanja: • Mršavost (svinja), slab prinos mleka (krave) (Anon, 1989),

11. Aflatoksini (4/5)Analitika aflatoksina u hrani Detekcija i kvantifikacija prisustva antigena (AFB1-protein) u uzorku se vrši korišćenjem: Fizičko-hemijska metoda: TLC, HPLC. Imunološks metoda: ELISA test (rutisnka analiza), Direktni kompetitivni test ELISA test se bazira na antigen-antitelo reakciji uz prisustvo agensa za razvijanje boje (u daljem tekstu substrat) AFB1-BSA (antigen): Konjugat se sastoji od AFB1 (aflatoksin) i BSA (govedji serumski albumin). Neophodno da se indukuju antitela. AFB1-BSA-Enzyme: AFB1-BSA veza s enzimom (enzimi mogu biti različiti: alkalnafosfataza, penicilinaza ili peroksidaza iz rena).

12. Sistem sa alkalnom fosfatazom (ALP) Udubljenja ELISA ploče su antitelom obloženih zidova Standardi (antigen-enzim) u prva dva reda: 50 µl opadajućih koncentracija kompleksa AFB1-BSA-ALP (rablaženje 1:2000). U preostale redove dodati kompleks i uzorak Inkubacijana37°C,1 h Isprati sa rastvorom PBS-T Ddodati 150 µl ALP substrata -(p-nitro-fenilfosfatomogućava bojenu reakciju) inkubacija 1 h, na tamnom mestu i na sobnoj temperaturi Čitati na 405 nm Pozitivna reakcija: opadajuća koncentracija standarda (AFB1-BSA-ALP) daje postepeno pojačanje boje od bezbojnog preko bledo –žute do jarko žute boje. Odsustvo boje – prisustvo visoke konc. AFB1 jarko žuta boja - nema AFB1 Sistem sa penicilazom (PNC) Udubljenja ELISA ploče su antitelom obloženih zidova Standardi (antigen-enzim) u prva dva reda: 50 µl opadajućih koncentracija kompleksa AFB1-BSA- PNC (rablaženje 1:10,000). U preostale redove dodati kompleks i uzorak Inkubacijana 37°C, 1 h Isprati sa rastvorom voda-Tween Dodati 150 µl PNC substrata(Penicilin G omogućava bojenu reakciju) inkubacija 1/2 h, na tamnom mestu, na sobnoj temperaturi Čitati na 620 nm Pozitivna reakcija: opadajuća koncentracija standarda (AFB1-BSA-PNC) daje boje od tamno plave preko zelene do narandžasto-žute. tamno plava boja - prisustvo visoke konc. AFB1 narandžasto-žuta boja - nema AFB1 Aflatoksini (5/5)Protokoli za ELISA testove: dva sistema

13. Fumonizini (1/2) Fumonizin B1 • najčešći i najvažniji Fumonizin B2 • Izvor: • Fusarium monilifome (najvažiji) • Fusarium proliferate • Fusarium nygamoni • Rasprostranjenost: • U kukuruzu (klip) i kukurznim proizvodima

14. Fumonizini (2/2) • FB1 i FB2 su veoma toksikološki značajni. • FB1 ispoljava toksičnost na: CNS, jetru, pankreas, bubrege i pluća • Klinička slika trovanja: • Ljudi: rak jednjaka (ređe jetre) Južna afrika i Kina. • Konj: neurotoksičnost • leukoencefalomalacija (LEM) kod konja: nekroza bele mase CNS (USA, Argentina, Brazil, Egipat, Južna afrika i Kina). • Svinje: plućni edem • Zakonska regulativa: • Švajcarska: max 1 ppm u hrani • Južna Afrika: 10-60 ppb u kukuruzu

15. Ohratoksni (1/2) • Izvor: • Aspergillus ochraceus - subtropska i tropska područja • Penicilium veridicatum • Penicilium cyclopium • Rasprostranjenost: • U kukuruzu, ječmu, ovsu, kikirikiju, kafi i vinu (Italija, Španija) • Učestalost trovanja: • Zemlje u razvoju: Brazil, Čile, Egipat, Senegal, Tunis, Indija, Indonesija. Pojasevi umerene i vlažne klime

16. Ohratoksni (2/2) • Klinička slika trovanja: • Oštećenje bubrega • tubularna nekroza, tumor bubrega, tumor mokraćnih puteva • Oštećenje jetre • Enteritis • Imunosupresiv • Teratogen • karcinogen: grupa 2B (nedovoljno podataka o karcinogenosti po ljude, a dovoljo za životinje) • Endemske nefropatije (fatalno, hronična bolest bubrega- neki delovi Bugarske i bivše Jugoslavije i Rumunije) • Ostljivost životinjskih vrsta: • Svinje • Ćurke i pilići (mnogo manje)

17. Trihoteceni (1/4) T2 toksin • najtoksičniji Deoksinivalenol (DON) • najčešći HT-2 Fusarenon X Diacetoksiscirpenol (DAS) • Izvor: Fusarium Sporotrichoides(glavni izvor T-2 toksina) Fusarium Graminearum(glavni izvorDON toksina) Fusarium Culmorum • Rasprostranjenost: • u žitaricama širom sveta, • nema ih u jajima i mlečnim proizvodima

19. Trihoteceni (3/4) T2 toksin • Mehanizam toksičnosti: • Sprečava proteinsku sintezu i replikaciju DNK • Aktivira dopaminske recetore u krvi • Klinička slika: • imunosupresiv • deluje na intestinalne ćelije u crevima • Dovodi do hemoragije • Neurotoksično dejstvo • Ograničeni podaci o karcinogenosti kod životinja • Ostljivost životinjskih vrsta: • Svinje (povraćanje) • Primeri trovanja: • Rusija – II SR , Sibir: (10% stanovnika otrovano- znatno smanjenje leukocita u krvi ljudi i životinja, 'alimentary toxic aleukia' (ATA)- groznica, povraćanje, enteritis, anemia, cirkulatorni kolaps i konvulzije). • Stahibotriotoksikoze i dendrodohiotoksikoze u životinja • Kašmir, Indija, (1987) trovanje hlebom spravljenog od plesnjivog brašna(abdominalni bolovi udruženi sa bolom i upalo grla, diareja, krava stolica i povraćanje) • Kao bojni otrovi (“žute kiše” T2 toksin? – Iransko- irački rat) • Anon, 1993 (trovanje usevima koji su se u ovim hladnim predelima čuvali preko zime, na vlažnom)

20. Trihoteceni (4/4) DON • Klinička slika trovanja: • izaziva povraćanje - vomitoksin, • imunosupresiv • Simptomi trovanja: • 5-30 minuta od ingestije: muka pvraćaje, abdominalni bolovi, dijareja, vtoglavica i glavobolja. • Primeri trovanja: • Indija, ruralni delovi Japanai Kine: 1984-85 - ishrana plesnjivim kukruzom. • Anon, 1993.

21. Zearalenon • Ima estrogensku aktivnost (estradiol-17b) • Glavni metabolit: a i b zearalenol • U kombinaciji je uvek sa T2 toksinom • Izvor: • Fusarium Voseum, • Fusarium Graminearum ...(Maracas, 1991). • Rasprostranjenost: • U kukuruzu i pšenici • Ostljivost životinjskih vrsta: • Svinje (hipertrofija uterusa i neplodnost).