Trawienie związków azotowych w przedżołądkach

1. Trawienie związków azotowych w przedżołądkach Szybkość uwalniania się amoniaku z różnych pasz w warunkch in vitro. mgr inz. Sybilla Jacqueline Berwid

2. ĆWICZENIA: Oznaczanie stężenia amoniaku w treści przewodu pokarmowego • Wykonanie krzywej standardowej • Przygotowanie standardów i ich inkubacja • Odczytanie ekstynkcji i wykreślenie krzywej • Oznaczenie prób badanych • Przygotowanie prób i ich inkubacja • Odczytanie ekstynkcji i znalezienie punktów na krzywej • Obliczenie stężenia N-NH3 w treści żwacza • Wg wzoru obliczamy stężenie w mmol/l N-NH3 AZOT-AMONIAKALNY

3. Wykonanie krzywej standardowej • Przygotowujemy standardy o zawartości 10,20,30 mg z roztworu siarczanu amonu (NH)4SO4 (o stężeniu azotu 100mg/100ml).Przygotowujemy też próbę ślepą, czyli bez azotu... • Dodajemy po 1 ml 10% Na2WO4 , oraz 1n H2SO4. • Pobieramy (w 3 powtórzeniach) próby w ilości 0,01ml, i dodajemy po 1,5 ml odczynnika I i II. • Po wymieszaniu wstawiamy standardy wraz ze ślepą do łaźni wodnej na 30 min (temp. +38°C) • Wykreślamy krzywą standardową, aby wyliczyć wartość 1 jednostki ekstynkcji i stężenie NH3 w próbach badanych

5. Wykonanie prób badanch 1 • Inkubacja treści żwacza • Przelewamy po 25 ml treści przez filtr i dodajemy związki azotowe: • K brak dodatku (próba kontrolna) • A 250 mg albuminy (białko osocza) • M 250 mg mocznika (NPN) • Po wymieszaniu wstawiamy próby wraz z kontrolą do łaźni wodnej na 30 min (temp. +38°C)

6. Wykonanie prób badanch 2 • Odbiałczenie prób i uzyskanie supernatantu • Do probówek (K,A,M) dodać po 1 ml 10% Na2WO4, 2 ml treści żwacza, 1 ml 1n H2SO4 • Wymieszać próby • Gilzy zrównoważyć na wadze • Odwirować (10 min.,4 tys obr/min) • Pobrać supernatant w ilości 0,01 ml, dodać kolejno po 1,5ml odczynnika I i II, wymieszać próby i inkubować w łaźni wodnej 30 min • Wartości ekstynkcji odczytać przy długości fali 630 nm

7. Wyliczenie stężenia N-NH3 w inkubowanych próbach treści żwacza • Odczytać z krzywej wartość ekstynkcji dla określonego standardu, odjąć ślepą i wyliczyć 1 jE (standard – ślepa)  mg% standardu 1 jE X X = 1jE = 0,03-0,04 • Obliczanie stężenia N-NH3 w treści żwacza (średnia z ekstynkcji prób – ślepa) x 1jE = mg N-NH3 /100ml (mg%) mg% N-NH3 x 0,71 = mmol N-NH3 /l (mmol/litr) mg% standardu różnica jE

8. Aktywność ruchowa żołądka wielokomorowego • Odruchowa regulacja i koordynacja skurczów przedżołądków umożliwia wykonanie skomplikowanych ruchów , w wyniku których pokarm jest mieszany. Może być on skierowany z powrotem do jamy ustnej w celu powtórnego przeżucia bądź do następnych odcinków przewodu pokarmowego.

9. 1) skurcz czepca, jego treść przelewa się do predsionka żwacza • 2) skurcz przedsionka żwacza, gęste i cięższe części treści wracają do czepca; lżejsze przechodzą do górnego worka żwacza • 3) skurcz górnego worka żwacza, przemieszczenie się gazów do przedsionka, mieszanie treści i wyciskanie płynu który spływa do dolnego worka żwacza • 4) skurcz worka dolnego który przesuwa płynną część do przedsionka • 5) skurcz worka ślepego dolnego który usuwa gazy do worka górnego • Po krótkiej przerwie pojawia się druga część cyklu także od podwójnego skurczu czepca. Dodatkowo występuje ruch gazów i przesuwanie ich w okolice wpustu (przygotowanie do odbijania) KRZYMOWSKI STR. 394 SCHEMAT

10. Przeżuwanie, odłykanie, odbijanie • Procesy występujące u zwierząt z rozwiniętymi przedżołądkami, charakterystyczne dla przeżuwaczy • Przeżuwanie  czas zależy od udziału pasz objętościowych, włóknistych. Pokarm rozdrobniony skraca czas przeżuwania • Odłykanie  jest to odruch, powrót treści przez przełyk i gardło do jamy ustnej.Udział włoknistych składników powoduje że w 2 fazie cyklu skurcz czepca jest silniejszy i przesuwanie treści w okolicę wpustową żwacza. W momencie wdechu pokarm jest zasysany i wspomagany przez ruchy antyperystaltyczne przełyku kęs dostaje się powtórnie do jamy ustnej gdize jest rozcierany ok. 1 min i powtórnie połykany • Odbijanie gazów średnio w ciągu godziny powstaje u krowy ok. 25-35l gazów: CO2, CH4, H,H2S; ich proporcje zależą od składu karmy i jego struktury. Produkowany gaz zbiera się w górnym worku żwaczowym, odsłaniając okolice wpustu. Odruch rozpoczyna się pobudzeniem presoreceptorów zlokalizowanych w okolicach wpustu i wrażliwych na ciśnienie gazów. Odbijanie odbywa się rytmicznie 1-2 min w ilości 0,5-1,7l

11. Drobnoustroje • Przedżołądki nie wydzielają żadnych własnych enzymów. Zachodzi w nich trawienie autolityczne dzięki enzymom zawartym w paszy; oraz trawienie dzięki enzymom bakteryjnym i pierwotniaczym • Warunki w żwaczu: beztlenowość, pH 6-7, temp. ok. 40°C • Bakterie i pierwotniaki stanowią około 10% płynu żwaczowego, bakterii jest ok. 109 w 1 ml, a pierwotniakow ok. 106 • Białko przechodzące do trawieńca w 70% jest pochodzenia bakteryjnego a w 30 % pierwotniaczego

12. Bakterie z rzędów: Pseudomonadales i Eubacteriales; z rodzaju: Ruminococcus Eubacterium Clostridium Bacteroides Streptococcus Pierwotniaki z podtypu Ciliata Isotricha Dasytricha Entodinium Diplodinium Główne rodzaje drobnoustrojów występujących w żwaczu Głodzenie zwierzęcia po 3 dniach prowadzi defaunizacji żwacza. Gwałtowne rozcieńczenie treści powoduje osmolizę pierwotniaków. Obniżenie poniżej pH 4,5 powoduje ich smierć.

13. Przemiany związków azotowych w żwaczu • Istotą przemian białka w żwaczu jest zdolność bakterii do enzymatycznego rozkładu białka pokarmowego,oraz do syntezy białka nie tylko z aminokwasów ale też ze związków azotowych niebiałkowych (NPN): • Mocznik • Amoniak • Siarczan amonu • Węglan amonu • Z białka roślinnego jak i z azotu niebiałkowego powstaje białko bakteryjne. Bakterie służą jako pokarm dla pierwotniaków. Dziennie trafia do trawieńca około 1-2kg białka drobnoustrojów, które stanowi główne źródło aminokwasów.

14. Aminokwasy są wykorzystywane w całości przez bakterie do budwoy ich białka lub ulegają przemianom dezaminacji, transaminacji, dekarboksylacji. • W wyniku dezaminacji powstaje ketokwas (który wchodzi w cykl przemian cukrowych LKT) oraz grupa aminowa która przekształca się w amoniak. • Amoniak wydalany poza bakterie może być wykorzystany przez inne bakterie lub krwią przekazany do wątroby, gdzie syntezowany jest z niego mocznik, który może być usuwany przez nerki lub odzyskiwany do sliny i żwacza gdze jest wykorzystywany przez bakterie posiadające enzym ureazę. KRZYMOWSKI STR. 400 SCHEMAT ureaza mocznik  CO2 + amoniak