1 / 15

Izolace RNA z živočišné tkáně

Izolace RNA z živočišné tkáně. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU. Zdroj RNA. Čerstvá tkáň živočišného původu Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana. Uchování a transport biol. materiálu.

ayita
Download Presentation

Izolace RNA z živočišné tkáně

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  2. Zdroj RNA • Čerstvá tkáň živočišného původu • Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana

  3. Uchování a transport biol. materiálu • Ihned po odběru bude následovat izolace zahájená homogenizací a lýzou vzorku. Lyzační pufr blokuje RNA-ázy. Některé postupy doporučují uchovávat lyzáty pro pozdější izolaci.

  4. Charakter zpracovávaných tkání • Buněčnost – u jater, sleziny i ledvin vysoká – max. 25μg na jednu kolonku • Přítomnost lipidů – nízká • Charakter extracelulární matrix – snadno mechanicky rozrušitelná

  5. Homogenizace tkání • Použijeme rotor stator homogenizátor

  6. Izolace nukleových kyselin • Použijeme RNeasy kit fy QIAGEN

  7. Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění

  8. Izolační kolonky

  9. 1,5% agaróza vTBE Izolace RNA 28S 18S

  10. Spektrofotometrické stanovení • Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica) • A260 – absorbance vlastní NA • A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA) • A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin) • A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

  11. Odstranění RNA-áz • DEPC diethyl pyrocarbonate • Karcinogen • Deaktivovatelný při 100 st.C http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

  12. Vlastní postup • Před prvním použitím nachystat roztoky. • Přidat čistý 96-100% ethanol k RPE pufru • Přidat β-merkaptoethanol k RLT pufru v poměru 10 μl na 1 ml pufru. Pozor po smíchání zůstává stabilní pouze 1 měsíc.

  13. Vložit vzorek tkáně (20-25 μg) do 1,5 nebo 2 ml eppendorfky a přidat 600 μl RLT pufru. • Okamžitě homogenizovat pomocí rotor stator homogenizátoru. • Centrifugovat 3 minuty při maximálních otáčkách a supernatant přenést do nové zkumavky.

  14. Přidat stejný objem 70% ethanolu a promíchat opakovaným nasátím pipetou. • 700 μl vzorku přenést na kolonku vloženou do sběrací zkumavky. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Možno nanést zbytek vzorku (max. 700 μl na jednu centrifugaci) a zopakovat postup • Nanést na kolonku 700 μl pufru RW1 Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.

  15. Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. • Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 2 min. při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a vyměnit sběrací zkumavku. • Centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g s čistou sběrací zkumavkou-snaha odstranit veškerý ethanol. • Kolonku vložit do 1,5 ml zkumavky. Nanést 50 μl RNase free water na střed membrány a centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g. • Při očekávaném výtěžku vyšším než 30 μg možno eluci zopakovat. • Část eluátu nanést na agarové ELFO, část změřit na spektrofotometru. • RNA uskladnit při -80 °C.

More Related