Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

2. Sběr materiálu na izolaci DNA • Obecné zásady: • v principu je možné použít kteroukoli část rostliny • ideální je čerstvý materiál • problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy), herbáře • brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů • pokud možno zdravou tkáň, neinfikovanou ostatními organismy • radši na jeden typ tkáně • výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně (např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP) • zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)

3. Fixace materiálu před izolací • Vysoušení • silikagel –asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem) • při pokojové teplotě nebo v sušárně taky funguje (mechorosty, lišejníky); ale herbářové položky rostlin mohou být problematické • vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku • vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě

4. Fixace materiálu před izolací • Nakládání do ethanolu • není příliš výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy) • Zamrazováním čerstvého materiálu • bez problémů, ale není nutné

5. Vlastní DNA izolace • Volba extrakční metody • jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství • kolik máme peněz a času: komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie) dražší (50-150 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.) ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky) čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou

6. Vlastní DNA izolace • Kroky izolace DNA: • homogenizace - rozrušení buněčné stěny • lyze buněčných membrán-pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA) • purifikace DNA - odstranění kontaminantů: • proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších... • fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny, • které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce • huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání • polysacharidy • RNA • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě

7. Vlastní DNA izolace Homogenizace materiálu - mechanicky: • středně velké kousky tkáně(<10 cm) v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné) • nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2) pro velké vzorky • drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem

8. Vlastní DNA izolace • Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak: • sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu • střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice) • Nevysušený materiál: • je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami) • pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty

9. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • NaOH metoda • velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!) • zvýšené pH denaturuje proteiny (DNazy), pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně, supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl) • i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů • nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR (nikdy ne např. AFLP!) • vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat

10. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí RNA • CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě • přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci: ◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat ◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny) (krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)

11. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu) pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením bílý DNA pelet (zabarvení značí nečistoty) • DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolema rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku • vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA • zabere ~4 h a víc

12. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • SDS extrakce • izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy) • vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem • RNasa A rozštěpí RNA • podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA • výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie • izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)

13. Vlastní DNA izolace 1 2 3 • Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA: • lyzační fáze, příp. odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany a ošetření RNasou A • navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice) • za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu • DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem) • uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou - objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí) • koncentrace získané DNA ale často nižší! • existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA

14. Vlastní DNA izolace • Skladování DNA: • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě • TE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů) • krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC • roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození - fragmentace) • nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování (používat alikvoty) • DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě

15. Kontrola kvality a kvantity DNA • 1) fluorimetricky • barvivo selektivní pro DNA (např. PicoGreen aj. komerční barviva) • vysoce přesné stanovení koncentrace DNA • senzitivní i pro koncentrace ~0.1 ng/µl • naměřená koncentrace není ovlivnění kontaminanty, ale nezjistíme jejich přítomnost!

16. Kontrola kvality a kvantity DNA • 2) pomocí spektrofotometru • A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin) • přístroj měří ~ 5 µl vzorku • z vlastní hodnoty A260 přístroj vypočítá koncetraci DNA • nutno brát s rezervou!!! proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8 (absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá) A320: mělo by být blízké 0 jiné hodnoty → znečištění, odhad koncentrace DNA je nadhodnocený (časté zejm. u CTAB izolace) A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)

17. Kontrola kvality a kvantity DNA nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1µl) • 3) ´od oka´ • zelené, hnědé, žluté nebo jiné zabarvení roztoku DNA, nebo přítomnost sraženin indikuje kontaminaci nežádoucími látkami, které můžou, ale taky nemusí inhibovat enzymatické reakce

18. Kontrola kvality a kvantity DNA • 4) elektroforéza (ELFO) • pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru • vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku) • záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace • vizualizace fluorescenčními barvivy, které se vážou na DNA (GelRed, SybrGreen, ethidium bromid) – potenciální mutageny

19. Kontrola kvality a kvantity DNA • ELFO genomové DNA • fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny) • pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce! • ... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci) čistá, kvalitní DNA: ◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA ◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací) smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA

20. Shrnutí Jakou metodu izolace DNA zvolit? (aneb některé typické situace, které můžou nastat) • potřebujeme kvalitní DNA v dostatečné kvantitě (např. AFLP), nebo pracujeme s problematickýmmateriálem (sek. metabolity): • komerční DNA kity; nepodcenit fixaci materiálu! (např. silikagel) • máme hodně vzorků (desítky-stovky), ale plánujeme metodu nepříliš náročnou na kvalitu a kvantitu DNA (sekvenování, SSR, příp. ISSR), a pracujeme s neproblematickým materiálem: • ideálně NaOH izolace • zpracováváme vzorky z malého množství tkáně, a kitová izolace má malý výtěžek; navazující metody nepříliš náročné na kvalitu DNA: • zkusit NaOH nebo CTAB protokol • nemáme dost peněz, nebo kitová izolace s malým výtěžkem, a potřebujeme metodu středně (ISSR) nebo vysoce (AFLP) náročnou na kvalitu a kvantitu DNA: • zkusit CTAB nebo SDS protokol (bez záruky, zejm. pro AFLP!)

21. Herbářový a historický materiál (Ancient DNA) • Co s herbářovým materiálem? • cenný zejména typový materiál taxonů, histor. sběry vzácných taxonů, histor. populační sběry apod. • recentní položky (<15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžné PCR metody - ale může se velmi lišit druh od druhu! • obvykle použitelné pouze pro některé metody analýzy DNA (zejména sekvenace PCR produktů nebo analýza SSR) • zatím nejstarší sekvenovaná herbářová položka rostliny je stará ca 200 let (Phaulopsis talbotii – Acanthaceae, Andreasen et al. 2009) • názory na optimální metodiku nejsou jednotné, každý druh (položka) funguje jinak... • ... radši nemít přehnaná očekávání Andreasen et al. 2009. Successful DNA amplification of a more than 200-year-old herbarium specimen: recovering genetic material from the Linnaean era. Taxon 58: 959-962.

22. Herbářový a historický materiál (Ancient DNA) Co s herbářovým materiálem? • pozor na kontaminaci recentním materiálem! • např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým herbářovým materiálem • u mechů a hub patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi! • při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem • výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu • doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček

23. Herbářový a historický materiál (Ancient DNA) • Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu: • patrně preferovat čistotu DNA nad její kvantitou; uváděné úspěšné metody izolace se často navzájem liší, nutné optimalizovat (pokus-omyl) • Särkinen et al. (2012) preferuje kombinaci CTAB izolace (vysoký výtěžek) + následné přečištění izolátu na kitové silika membráně (zvýší čistotu) • Drábková et al. (2002) preferuje pro Juncaceae kitovou izolaci (Qiagen), popř. CTAB protokol • u hub a lišejníků byly úspěšné pokusy s kitovou izolací (Qiagen, Sohrabi et al. 2010), CTAB protokol (Redchenko et al. 2012), příp. jejich kombinace (May et Ristiano 2004) Drábková et al. 2002. Comparison of seven DNA extraction and amplification protocols in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter 20: 161-175. Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808.

24. Herbářový a historický materiál (Ancient DNA) Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu: • nejnižší úspěšnost u materiálu naloženého v lihu; nepotvrdil se negativní vliv vysoušení za vyšších teplot (Särkinen et al. 2012) • velmi záleží i na metodice následného zpracování vyizolované DNA: fragmenty genomové DNA (CTAB izolace Spergularia sp., 2 položky staré ca 70 let) • některé typy komerčních polymeráz dávají lepší úspěšnost PCR amplifikace • DNA hist. vzorků je fragmentovaná → větší šance na úspěch při amplifikaci kratších úseků DNA (< ca 300 bp, např. SSR) ► Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808. Telle et Thines 2008. Amplification of cox2 (~620 bp) from 2 mg of up to 129 years old herbarium specimens, comparing 19 extraction methods and 15 polymerases. PLoS One 3: e3584.