Bioelektrické jevy a jejich měření 7. přednáška

1. Bioelektrické jevy a jejich měření 7. přednáška

2. - + + + - - Pro připomenutí z minulé přednášky Živé organismy jsou prostorové vodiče. Lze na nich provádět i elektrická měření na struktuře, k níž není přímý přístup, neboť změny potenciálů v této izolované struktuře (tkáni, orgánu) jsou indukovatelné i na povrchu tohoto vodiče nebo v něm. Každá vzrušivá buňka se při podráždění a průchodu AP chová jako dipól. Průchod AP vyvolá vznik elementárního elektrického pole na každé jednotlivé vzrušivé buňce. Každé toto pole má určitou velikost. Jednotlivá elementární elektrická pole všech buněk v tkáni dají v součtu výsledné elektrické pole, resp. výslednou sumu dipólů v dané vzrušivé struktuře. Mezi dvěma ekvipotenciálními plochami nenaměříme žádný napěťový rozdíl, ať už jde např. o povrchový náboj buňky kladný nebo záporný. Napěťový rozdíl naměříme jen při existenci dipólu na struktuře. Místa aktivity jsou vždy děrami  kde je aktivita, tam je negativní náboj, a naopak neaktivní místa jsou zdroji, tedy místy s kladným nábojem. Pokud tedy máme jednu snímací elektrodu (a referenční elektrodu, oproti které se měří, tzv. unipolární svod), směřuje-li vlna depolarizace od této elektrody, zaznamenává se záporná výchylka. Pokud směřuje depolarizační vlna k elektrodě, zaznamenává se kladná výchylka. Změna napětí klesá se vzdáleností. Pokud se pohybujeme na povrchu nějaké struktury, dostaneme obraz rozložení potenciálů na dipólu. To, co snímáme jako EEG či EKG, ERG... je projev sumace dipólů v dané struktuře (mozku, srdci) vůči referenční elektrodě.

3. bělima cévnatka sítnice rohovka zornice čočka optický nerv duhovka ciliární tělísko Oko – generátor elektrických potenciálů  Du Bois-Reymond a potenciály – oko je také generátor elektrických potenciálů  do poloviny minulého století spíše experimentální záznamy elektrických projevů oka, až od 50. let klinická aplikace v očním lékařství (skandinávský oftalmolog Karpe, u nás dr. Vanýsek)  dříve metoda nazývána prostě elektroretinografií (ERG), dnes „oční elektrofyziologie“ = komplex různých metod Elektrické potenciály snímány z oka pomocí • speciálních elektrod ve tvaru kontaktních čoček (Ag kroužek či ploška na konkavitě čoček) – oko udržováno otevřené, elektroda „plave“ na rohovce • „suction cup electrodes“ • závěsné čočka na dolním okraji víčka • fixování elektrod na víčka náplastí přes vodivou pastu ERG je užívána k měření elektrických odpovědí různých buněčných typů sítnice (mj. fotoreceptorů či gangliových buněk). Je to souhrnný záznam odpovědí různých buněčných elementů sítnice. Pacient sleduje standardizované stimuly a výsledný signál je interpretován z hlediska voltáže a časových parametrů. Elektrofyziologická vyšetření používá oftalmologie jako doplňující vyšetření sítnicových funkcí. Hodí se např. v případech, kdy je sítnicový potenciál nevýbavný (pigmentová degenerace sítnice, hemeralopie) nebo snížený (odchlípení sítnice, chorioretinitidy, diabetická retinopatie aj.), u degenerací postihujících zadní pól oka, trombotických postižení sítnice, atrofií zrakového nervu a pod. Na izolovaných buňkách sítnice lze samozřejmě pracovat technikami typu klasické intracelulární snímání či patch clamp.

4. Burianovy elektrody Během záznamu ERG je zornice obvykle dilatována. Většina elektrod je unipolárních.

5. Současné vyšetřovací metody oční elektrofyziologie A) Skotopický elektroretinogram (S-ERG) Je získáván na oku adaptovaném na tmu. Potenciál je snímán z tyčinek celé sítnicové plochy po difúzní světelné stimulaci. Má tvar bifazické až trifazické křivky, kde negativita zobrazuje polarizační děje tyčinek, pozitivita šíření proudů v bipolárních buňkách sítnice. Následná pozitivní vlna "c" se získává při delších stimulačních osvitech, není konstantní a při hodnocení záznamů je málo využívána (pigmentový epitel). Při hodnocení se opíráme o výšku a časový výskyt potenciálu. B) Fotopický elektroretinogram (F-ERG) Je snímán na oku adaptovaném na světlo. Snímá potenciály čípků při osvětleném pozadí ("background illumination"). Intenzita osvitu stimulu je asi 100x větší. Negativita zobrazuje činnost čípků, pozitivita opět šíření vzruchů v sítnici. C) Oscilační potenciály ERG Metoda je málo rozšířena pro technickou náročnost. Potenciály jsou zobrazovány jako drobné oscilační vlnky na pozitivní odpovědi ERG a to jen při určitém rozsahu frekvence. Vznik těchto potenciálů bývá dáván do souvislosti s horizontálním šířením vzruchů v sítnici. Záznamy jsou obdobné jako předchozí ERG, ale jsou v minimální voltáži (2 až 85 mV). D) ERG na strukturované podněty (Pattern reversal ERG = P-ERG) Při tomto vyšetření používáme místo difúzního podnětu podnět strukturální (šachovnice, horizontální nebo vertikální pruhy). Tyto podněty mění navzájem místo - reverzují. Tato metoda v podstatě objektivně znázorňuje kontrastní citlivost. Potenciály jsou generovány v gangliových buňkách sítnice.

6. b – vlna (proudy bipolárů) a – vlna (proudy tyčinek) Standardní elektroretinogram • Měří se a vyhodnocují • Amplituda (od základní linie) k maximu negativní výchylky vlny a • Amplituda (od základní linie) k maximu pozitivní výchylky vlny b • Čas t od aplikace stimulu k výskytu maxima negativní výchylky vlny a • Čas t od aplikace stimulu k výskytu maxima pozitivní výchylky vlny b • Tyto časy zobrazují latenci výskytu vrcholků vln a označují se jako „implicitní časy“. a – vlna je také někdy označována jako „pozdní receptorový potenciál“ a odráží základní (zdravý) fyziologický stav fotoreceptorů vnější retiny. b-vlna je odrazem stavu vnitřních vrstev sítnice, včetně „on“ bipolárů a Müllerových buněk.

7. Oscilační potenciály Oscilační potenciály jsou pozorovatelné na vzestupném raménku b-vlny, a to při skotopických i fotopických ERG. Prvně byly popsány Cobbem a Mortonem v roce 1954. Pokud odfiltrujeme (1-100 Hz) pomalejší složky záznamu (a- a b-vlny), dostaneme salvy oscilačních potenciálů. Jsou zřejmě projevem aktivity amakrinních buněk vnitřní sítnice. 2 až 85 mV ERG velmi silně ovlivňuje chemický stav sítnice. Dlouhá léta se používal roztok glycinu jako omývání při odstraňování zvětšené prostaty. Pokud zákrok trval dlouho nebo pokud chirurg řízl hluboko do cévního zásobení a pokud byl pacient jen pod slabou a víceméně lokální anestézií typu epidurál, stalo se, že probuzený pacient se tázal, proč najednou zhasla světla. To personál v jasně osvětlené místnosti zpravidla zmátlo. Glycin je inhibiční neuropřenašeč spojený v sítnici s amakrinními buňkami. Pokud se dostane do oběhu a až k amakrinním buňkám, „vypne“ zdroje oscilačních potenciálů. Ty mizí ze vzestupného raménka b-vlny. Potenciály i zrak se vrátí pacientovi po pár hodinách, až je glycin zmetabolizován :-)

8. Záznam ERG se liší při použití různých elektrod. Klasika – Burianovy rohovkové elektrody Malé oči (nezralí novorozenci aj.) – Jet sety Mikrooftalmie, poškození tkáně okolí oka – uhlíková či kovová vlákna

9. E) Zrakově vyvolané odpovědi na strukturovaný podnět (ZVO, P-VEP = Visual Evoked Potentials) Na rozdíl od předchozích metod, pomocí tohoto vyšetření sledujeme funkci zrakového nervu, který v předchozích metodách nebyl dosažitelný. Ke stimulaci využíváme opět reverzní strukturované podněty. Elektrody fixujeme na hlavě v okcipitální krajině. Získaný potenciál se skládá ze dvou negativit a jedné pozitivní vlny, o kterou se hlavně opíráme při hodnocení. Zde se soustřeďujeme nejen na výšku potenciálů, ale i na čas objevení pozitivních a negativních potenciálů v ms. Registrujeme je obvykle v obrácené polaritě. Jsou generovány gangliovými buňkami sítnice a axony zrakového nervu. F) Elektrookulografie (EOG) Tato metoda sleduje tzv. klidové potenciály oka. Zde zaznamenáváme rozdíl mezi pozitivní rohovkou a negativitou zadního pólu oka. Nemocný sleduje fixační světla červené barvy při pohledu do 30°. Vznikají potenciály, které se zvyšují po 10 minutách vyšetření za tmy po navození fotopického background osvětlení. Elektrody fixujeme při zevních a vnitřních koutcích oka, které při pohybu prakticky vytváří elektrický dipól a dle toho, který potenciál se přiblíží k diferenční elektrodě, nám nakreslí výchylku. • Skotopický ERG: pigmentová degenerace sítnice, hemeralopie, difúzní postižení sítnice (odchlípení sítnice, chorioretinitidy, diabetická retinopatie, metalosy) • Fotopický ERG: u degenerací postihujících zadní pól oka (Stargardtova degenerace, hyalinní degenerace, Sorsbyho degenerace), trombotických postižení sítnice a diabetické postižení cév • Pattern ERG: poruchy makuly (makulopatie) a amblyopatie • Pattern VEP: choroby zrakového nervu, intraokulární neuritida, retrobulbární neuritida, atrofie zrakového nervu, onemocnění CNS • EOG: hereditární abiotrofie zadního segmentu oka

10. Normální záznam Retinitis pigmentosa

11. Zdravý otec Matka přenašečka Dcera nemocná Myotonická dystrofie

12. Elektrookulogram Elektrookulografie je metoda, která také umožňuje určit směr, kterým se dívá oko. • To je možné díky tomu, že oko je v podstatě kulová baterie s kladným pólem vpředu na rohovce a záporným na sítnici. Potenciál mezi přední a zadní stranou oka se pohybuje mezi 0,4 a 1 mV. • Umístěním elektrod po obou stranách očí umožňuje měřit pohyb očí v rozsahu +/-70° horizontálně a +/-90° vertikálně. • Napětí na elektrodách se mění s měnící se vzdáleností rohovky od elektrody. Pokud oko hledí přímo dopředu, je napětí na protilehlých elektrodách stejné. Pokud se oko podívá například doprava, zvýší se kladné napětí na pravé elektrodě.

13. Elektrookulogram V talíři tzv. Ganzfeldu jsou dvě fixovaná orientační červená světla. Pacient adaptovaný na světle pohybuje očima mezi nimi a zaznamenává se tzv. baseline (1). Během pohybu očí se píší výchylky asi 5 mV. Posléze se na 15 min zhasne a probíhá adaptace na tmu. Zaznamenávaný potenciál se snižuje, nejnižších hodnot dosahuje mezi 8-12 min adaptace (2). Po opětovném rozsvícení potenciál roste, s maximem asi 10. minutu po osvitu (3). (1) (2) (3) Poměr maxim výchylek při jasném osvitu / ve tmě nad 1,7-2,0 je normální. rozmístění elektrod při EOG

14. Při různých chorobách se poměr světlo/tma liší, zpravidla klesá. Pacient s Bestovou chorobou (vitelliformní makulární dystrofie): 1,33. • Jednou ze základních funkcí oka je schopnost zaměřit (zafixovat) se na určitý předmět. Pokud je oko zafixováno na nějaký předmět, tak jeho obraz se promítá na sítnici do oblasti žluté skvrny (fovea). Okohybné svaly udržují obraz ve žluté skvrně, ať se zafixovaný předmět pohybuje nebo ne. • Existují dva základní mechanizmy fixace: • volní fixace – umožňuje vůlí zaměřit pozornost na určitý předmět • mimovolní fixace – udržuje zafixovaný objekt v zorném poli • Pomocí volní fixace je možné vybrat objet, na který je poté oko zafixováno a dále je objekt již sledován mimovolní fixací. Dokonce, i pokud je zrak zafixován na nehybný objekt, oko není nikdy nehybné, ale stále vykonává drobné mimovolní pohyby.

15. Mimovolné pohyby rozdělujeme na • tremor – třes – drobné pohyby s frekvencí 30-80Hz • drift – pomalé pohyby – méně než jeden úhlový stupeň • kmitavé pohyby – mikrosakády, trhavé pohyby, které vracejí zafixovaný objekt do fovey, pokud jí vlivem driftu začne opouštět • Kmity tedy kompenzují drift a mají tudíž opačný směr (i když to nemusí být přesně 180°). • Při sledování pohybujícího se objektu provádí oko dlouhé pomalé sledovací pohyby. Přestože prvotní zafixování na pohybující se objet je způsobeno vůlí, další sledování už je automatické. • Jiné pohyby vykonává oko při čtení nebo při sledování pohybující se scény (při pohledu na běžícího psa či při při pohledu z jedoucího vlaku). Spíše než pomalé sledovací pohyby vykonává pak oko velké skokové pohyby, zvané sakády. • Sakády jsou v podstatě série zafixování na blízké body následující rychle za sebou. Jednotlivé skoky v skádách jsou od sebe obvykle vzdáleny kolem 300 ms. V době mezi sakádami mozek potlačuje vizuální vjem, takže rozmazání obrazu vlivem pohybu oka nevnímáme. Typicky oko stráví přibližně 10% času sakádami a 90% času je zafixováno na jednotlivé předměty, avšak variabilita těchto hodnot je značná. záznam sakád při čtení textu „Saccadic movements jump from place to place.“

16. EOG záznam při pohybu předmětu v zorném poli plynule od středu zorného pole doleva pod úhlem 70°, zpět do středu a doprava pod úhlem 70° a zpět do středu zorného pole EOG záznam při pohybu předmětu v zorném poli plynule od středu zorného pole nahoru pod úhlem 70°, zpět do středu a dolů pod úhlem 70° a zpět do středu zorného pole

17. pigmentový epitel tyčinky, čípky outer limiting membrane Műllerovy buňky horizontální buňky bipolární buňky amakrinní buňky gangliové buňky vrstva nervových vláken inner limiting membrane Struktura lidské sítnice • - retina je cca 0,5 mm silná • lemuje zadní část oční koule, mnoho buněčných typů • gangliové buňky (výstupní neurony sítnice) leží nejpovrchněji, směrem k čočce a přední části oka, fotoreceptory nejvnitřněji, směrem k pigmentovému epitelu a cévnatce; světlo musí projít sítnicí • v centru sítnice je zrakový nerv (ovál či kruh cca 2 x 1,5 mm), z jeho středu vybíhá hlavní cévní zásobení sitnice • 17° (4,5-5 mm) od něj je fovea (její střed oftalmology označován jako žlutá skvrna, macula lutea) s maximální hustotou čípků organizovaných do hexagramů • žlutá skvrna díky karotenoidům xantofylové řady zeaxanthinu a luteinu (v axonech čípků v tzv. Henleově vrstvě), zřejmě ochranný filtr (aditivní k čočce) proti krátkovlnnému záření

18. epithel tyčinky, čípky tyčinky, čípky fotoreceptory fotoreceptory vnější jaderná vrstva vnější plexiformní vrstva horizontální buňky horizontální buňky bipolární buňky vnitřní jaderná vrstva amakrinní buňky bipolární buňky vnitřní plexiformní vrstva amakrinní buňky gangliové buňky axony gangliových buněk vrstva gangliových buněk axony gangliových buněk koncové patky Műllerových buněk • Sítnice všech savců je složena ze 3 vrstev těl nervových buněk a dvou vrstev synapsí (neuropil). • Vnější jaderná vrstva obsahuje těla tyčinek a čípků. • Vnitřní jaderná vrstva obsahuje těla bipolárů, horizontálních a amakrinních buněk. • Gangliová vrstva obsahuje těla gangliových buněk a zbloudilých buněk amakrinních. První neuropilou je vnější plexiformní vrstva se synapsemi mezi tyčinkami a čípky, kolmo běžícími bipoláry a horizontálními buňkami. Drouhou neuropilou je vnitřní plexiformní vrstva sloužící jako přepojovací stanice mezi buňkami vedoucími vzruchy v kolmém směru (bipoláry) a gangliovými buňkami. Jsou v ní také amakrinní buňky orientované kolmo i podélně; ovlivňují a integrují signály předávané gangliovým buňkám.

19. Lidská sítnice je precisní systém přesně organizovaných fotoreceptorů, neuronů, glií a cévního zásobení: poškození sítnice nebo její degenerativní změny mohou vést až k slepotě. Jedním z nejčastějších důvodů slepoty je se stárnutím spojená degenerace žluté skvrny/fovey. Pigmentový epitel degeneruje a tvoří drobné krystalky. Zpoza fovey prosakuje tekutina. Čípky zahynou, ztrácí se centrální zraková ostrost, nemůžeme číst či vidět drobné detaily. Diabetická retinopatie je způsobena změnami v cévním zásobení sítnice. Cévy se zkroutí a nekontrolovatelně rozvětvují. Dnes se nejčastěji využívá laseru k zastavení proliferace cév a zastavení průsaků do retiny. Glaukomy jsou také doprovodným jevem stárnutí. Přední komora oční není schopna Retinitis pigmentosa je dědičná nemoc s mnoha projevy, podložena větším množstvím genetických mutací. Většina poškozených genů souvisí s fotoreceptory. V časných fázích choroby degenerují tyčinky periferní sítnice, pacienti ztrácejí zrak postupně, jak odumírá periferní sítnice. zajistit normální tok nitrooční tekutiny, roste nitrooční tlak. Dochází k devastaci cévního zásobení zejména u odstupu optického nervu a axonů gangliových buněk, takže tyto jinak velmi vitální buňky umírají. Může jim zůstat tzv. tunelové vidění, kdy není afektována fovea. Charakteristickým projevem je výskyt tmavého pigmentu a ztenčení cévního zásobení u odstupu očního nervu.

20. červené stimuly zelené stimuly napětí (mV) tlumené světelné pulsy čas změny napětí v tyčinkách typy želvích čípků s olejovými kapénkami opičí tyčinky – odpovědi na 0, 1 a 2 kvanta Intracelulární snímání z jednotlivých buněk sítnice V retině obratlovců jsou dva základní typy fotoreceptorů. Tyčinky obsahují pigment rhodopsin a jsou citlivé na modrozelené světlo, s maximem citlivost kolem 500 nm. Velmi citlivé fotoreceptory užívané pro vidění za snížených světelných podmínek. Čípky obsahují opsiny a jejich zrakové pigmenty jsou různě citlivé na různé vlnové délky podle typu opsinu: • lidské L-čípky jsou maximálně citlivé na červené světlo (564 nm) • M-čípky na zelené světlo (533 nm) • a S-čípky na světlo modré (437 nm) Schneeweis and Schnapf (1995) Většina savců je dichromatických (M- a S-čípky). Primáti, lidé, ptáci, plazi a ryby jsou trichromatičtí až pentachromatičtí (poslední 3 třídy). opičí čípky

21. Tyčinky jsou velice citlivé, ale na světelné stimuly odpovídají pomaleji než čípky. Signál vyvolaný světlem o určité intenzitě doběhne na synapsi až o 0,1 s později než signál z čípků, vyvolaný stimulem stejné intenzity ve stejnou dobu (MacLeod, 1972). „Triáda“ čípku je tvořena centrálním elementem (dendritickou terminálou invaginujícího bipoláru, imb) a dvěma přilehlými dendritickými terminálami horizontálních buněk (hc). Na nožce čípku mohou tvořit synapse také dendritická zakončení jiných typů bipolárních buněk. Patka čípku má až 30 synaptických hřebínků asociovaných s přilehlými terminálami axonů. Průměr patky čípku je 8-10 mm. Patka tyčinky má dva synaptické hřebínky asociované se dvěma přilehlými terminálami axonů horizontálních buněk (hc). Invaginují do ní také dva dendrity bipolárů (rb). Průměr patky tyčinky je 3-5 mm. Na synaptických hřebíncích jsou zakotveny váčky s neuropřenašeči. Po výlevu excitují/inhibují membrány horizontálních a bipolárních buněk.

22. Horizontální buňky První evokované (světlem) potenciály naměřené intracelulárními elektrodami z nervových buněk obratlovčí sítnice byly tzv. S-potenciály (Svaetichin, 1953). Jsou to negativní potenciály, které trvají po celou dobu aplikace podnětu. Mají graduující charakter: čím je podnět jasnější, tím je větší amplituda S-potenciálů (až do dosažení saturační úrovně, obr. A). U dlouhých stimulů stejné intenzity se mění doba S-potenciálů, ne jejich amplituda. Ta klesá až s výrazným zkracováním signálu (obr. B). Do určité doby trvání podnětu je amplituda odpovědi úměrná součinu doby trvání a (kvantového) obsahu podnětu, pro dlouhé stimuly už jen kvantovému obsahu podnětu. (Toto je vlastně ilustrace Blochova zákona.) S-potenciály byly pojmenovány podle Gunnara Svaetichina, dnes to znamená „pomalé potenciály“ (slow p.) Mezi neurofyziology vyvolaly S-potenciály v 50. letech zmatek. V té době se počítalo jen s depolarizací neuronů excitačními synapsemi; při překročení prahové hodnoty depolarizace vznikl akční potenciál. S-potenciály ale nezávisely ani na AP, ani na světlem navozené depolarizaci. Svaetichin měl za to, že jde o potenciály čípků. Až intracelulární značkovací techniky ukázaly, že zdrojem S-potenciálů jsou horizontální buňky. Horizontální buňky (HB) jsou neurony (druhého řádu) propojující navzájem fotoreceptory ve vnější plexiformní vrstvě sítnice. Prvně byly popsány v retině ryb. Morfologicky rozlišujeme dva hlavní typy HB: • B- typ s axony a • A-typ bez axonů.

23. želva světločivý typ B-typ s axonem kočka primát kočka primát myš A-typ bez axonu „modrá-žlutá“ typ želvy ptáci ryby bez axonu color-opponent typ 100 mm modré čípky červené čípky zelené čípky B-typ HB je spojen s vnímáním změny intenzity světla a upravováním adaptačních a prostorových odpovědí kolmých neuronálních spojů. Mohou být identifikovány pomocí protilátek proti Ca2+-vážícím proteinům nebo GABA. U želv byl v dendritech HB H1 typu objeven acetylcholin. V savčí sítnici mají asi dlouhé a tenké výběžky horizontálních buněk elektricky izolovat a fyziologicky oddělovat informace přenášené z jednotlivých dendritických polí – oddělit informace z čípků od informací z tyčinek. A-typ HB je v savčí sítnici vzácnější a spojuje pouze čípky, nikoliv tyčinky (většina druhů má jen modré a zelené čípky). Dokonce i u trichromátů jsou A-typy HN spojeny hlavně s modrými čípky. U některých velkých koček je i rozlišení kontaktu podlé délky dendritu: delší dendrity propojují modré čípky, dendrity blíže tělu HB zelené čípky. U koňů jsou tyto HB spojeny jen s modrými čípky. U obratlovců s vyjímkou savců existují ještě subtypy druhotně bez-axonatých HB (dole), spojených s čípky citlivými na určitou barvu. Sítnice nesavčích tříd obratlovců (jako např. ryby s dominancí tyčinek) mají specifické HB spojující tyčinky, zatímco savčí retina s dominancí čípků má HB s axonem výhradně k propojování čípků (šedá pole kolem terminál axonů, nahoře). Fyziologicky lze HB dělit na HB světločivé (luminosní) a barvocitlivé typy.

24. králík pulec L-typ HB červeno-zelená C-typ HB opice žluto-modrá C-typ HB stoupající intenzita Z fyziologického hlediska rozlišujeme na základě odpovědi na barevné světelné stimuly 2 typy HB: L-typ HB odpovídá na osvit jakoukoliv vlnovou délkou ve viditelné oblasti spektra vždy hyperpolarizací, zatímco C-typ reaguje z hlediska změny polarity různě podle vlnové délky světla (Svaetichin & MacNichol, 1958). • světločivé (L-typ) a • barvocitlivé (C-typ). L-typ HB. Odpovědi byly vyvolány různou intenzitou podnětů. C vs. L-typ HB. Různé vlnové délky vyvolávají pro různé C-typy HB různé odpovědi. Každá vlnová délka byla měřena při několika intenzitách poděntů. Vlnová délka, při které se mění polarita odpovědi C-typu HB, se nazývá nulová vlnová délka. Např. u kaprouna je nulová vlnová délka bifázických HB kolem 640 nm, trifázických HB kolem 500-530 nm a 650-670 nm.

25. L-typ HB log relativní citlivosti log relativní citlivosti žluto-modrá C-typ HB vlnová délka (nm) vlnová délka (nm) log relativní citlivosti červeno-zelená C-typ HB vlnová délka (nm) Spektrální vlastnosti HB se určují pomocí slabých stimulů vyvolávajících odpověď nižší než 1 mV. Lze tak určit vztah mezi citlivostí HB na světelný stimulus a vlnovou délkou stimulu. L-typ (tady spektrum z 8 L-typů) HB je nejcitlivější na stimuly o dlouhé vlnové délce, což se dá očekávat – jejich hlavní excitační vstup je z červených čípků. L-typ HB má navíc ještě excitační vstup z zelených a v malé míře i modrých čípků. Červeno-zelený podtyp C-typu HB je charakterizován zvratem polarity odpovědi kolem 600 nm. Tyto buňky mají excitační vstupy ze zelených a modrých čípků a inhibiční vstupy z červených. Žluto-modrý podtyp C-typu HB je charakterizován zvratem polarity odpovědi kolem 540 nm. Má inhibiční vstupy ze zelených a červených čípků a excitační vstup z čípků modrých, a také z UV-sensitivních čípků.

26. velká plocha podnětu malá plocha podnětu feedback čas (s) Zpětná vazba pomocí horizontálních buněk V sítnicích všech obratlovců jsou HB v rozsáhlých oblastech povrchu vybaveny vodivými spojeními (gap junction, průkaz luciferovou žlutí či neurobiotinem). Ta umožňují laterální toky malých molekul a iontů až mezi stovkami propojených HB. Sítě vznikají jen mezi HB stejného fyziologického typu. Funkci sítě ovlivňuje stav intra- a extracelulárního prostředí, dopamin, kyselina retinová, NO a další látky uvolňované sousedními buňkami. HB jsou vůči fotoreceptorům buňky postsynaptické (s výjimkou některých studenokrevných, kde jsou i presynaptické). Čípkům posílají HB visuální informaci pomocí zpětnovazebných drah. Pokud osvětlíme (mločí) sítnici podněty stejné intenzity, ale různého rozsahu, dostaneme různé odpovědi. První fáze („on“-fáze“ je stejná a nezávislá na ploše stimulu – jde o hyperpolarizaci. Při malé ploše stimulu (zelený kroužek) se buňka pomalu navrací ke klidové (temnostní) hodnotě membránového potenciálu, ale zůstává stále mírně hyperpolarizovaná po celou dobu trvání podnětu. Při velké ploše podnětu následuje po počáteční hyperpolarizaci depolariazční fáze, i když podnět stále trvá. Tento pozdní depolarizační potenciál je projevem aktivace zpětnovazebného okruhu HB.

27. Zpětná vazba pomocí horizontálních buněk Negativní zpětnovazebné okruhy jsou asi zprostředkovány invaginací postranních výběžků HB do triády či sféry terminály fotoreceptoru. Zprostředkujícím neuropřenašečem může být do určité míry zřejmě GABA. GABA-indukované proudy mohou být naměřeny na terminálách čípků citlivých v červené a zelené oblasti, přinejmenším u želv a ryb. U jiných druhů se toto ale prokázat nepodařilo. GABA nicméně zůstává neuropřenašečem aktivním na dendritech bipolárních buněk. „Triáda“ čípku je tvořena centrálním elementem (dendritickou terminálou invaginujícího bipoláru, imb) a dvěma přilehlými dendritickými terminálami horizontálních buněk (hc). Na nožce čípku mohou tvořit synapse také dendritická zakončení jiných typů bipolárních buněk. Patka čípku má až 30 synaptických hřebínků asociovaných s přilehlými terminálami axonů. Průměr patky čípku je 8-10 mm. Podle recentnějších dat (Kamermans et al., 2001; Janssen-Bienhold et al., 2001) ve studiích užívajících voltage-clamp jsou zpětnovazebné okruhy regulovány napěťově ovládanými vápníkovými kanály v nožkách čípků. HB podle tohoto modelu mohou navodit značné extracelulární toky dovnitř buňky přes hemi-gap junction kanály v boční části synapse. Během světelné stimulace se membrána L-typu HB hyperpolarizuje, velikost extracelulárních proudů klesá, to ovlivňuje napěťově ovládané Ca2+ kanály na nožce čípku - a tedy i membránový potenciál. Průkaz: pokud zablokujeme specificky gap-junctions pomocí karbenoxolonu (specifického blokátoru gap junction), zrušíme zpětnovazebný signál v čípku.

28. Elektromyografie (EMG) EMG je medicínská technika užívaná k měření odpovědí svalů na stimulaci motorických nervů. Provádí se za pomocí kovových elektrod (Adrianovy koncentrické jehly, nekoncentrické elektrody... viz 3. přednáška), vyšetření (mírně) invazivní. „Needleless-EMG“ neposkytuje tak přesné informace. Elektromygraf detekuje elektrické potenciály generované svalovými vlákny při kontrakci. EMG pracuje s potenciály v řádech 50 mV až jednotky mV. Typická svalová odpověď se pohybuje ve frekvencích 7-20 Hz, v závislosti na velikosti svalu (svaly oka vs. např. m. gluteus), předchozímu poškození nervu, různým chorobám a pod. EMG je vhodné k diagnostice řady chorob a poškození kosterních svalů a motorických nervů, neuropatií, neurodegenrativních chorob. Může odhalit příčiny paralýz kosterních svalů, mimovolních kontrakcí, patologických hladin svalových enzymů. Dokáže odlišit svalovou slabost navozenou nemocí a způsobenou bolestí či nedostatkem motivace. Užívá se také ve studiu biofeedbacku a tréninku pacientů, kteří se učí ovládat tensi svalů v obličeji, krku a ramenech – např. pacienti s migrénou. Postup • přes kůži se zavede elektroda; zaváděči aktivita pozorovaná při vpichu také vypovídá o stavu svalu a jeho inervujícího nervu • zaznamená se klidová aktivita svalu; spontánní kontrakce mohou indikovat poškození nervu • pacient lehce kontrahuje sval; zaznamená se tvar, velikost a frekvence výsledného potenciálu motorické jednotky • elektroda se posune o pár mm, opakuje se totéž, dokud se nezaznamená aktivita 10-20 jednotek; jednotlivé záznamy z elektrody poskytují jen velmi lokální obrázek o aktivitě celého svalu, který může mít v různých místech různou strukturu

32. Normální aktivita • levý triceps, boční hlava, n. radialis, kořen nervu C7 • CMUAP´s = compound motor unit action potentials • Potenciál motorické jednotky „tvaruje“ počet vláken/jednotka, metabolický typ vláken aj. • V klidu nejsou na EMG detekovány akční potenciály (chabá relaxace: 6-10 výbojů za vteřinu). S postupnou kontrakcí se AP objevují a při plné kontrakci se mohou vyskytovat nepravidelné skupiny APs různých rychlostí a tvarů.

33. Normální aktivita • typická EMG jehla zaznamenává z hemisféry o průměru 1 mm • v té až 100 vláken  typicky 4-6 vláken z 1 motorické jednotky • potenciály motorické jednotky • • amplituda do 2 mV • • trvání 10-15 ms • • 3-4 fáze • Reinervace: • • amplituda 10-20 mV • • trvání 20-30 ms • Primární svalové choroby: • • amplituda do 0,5 mV • • trvání 5-10 ms Překryv jednotlivých akčních potenciálů vláken jedné motorické jednotky u zdravého (A) a reinervujícího (B) svalu M. deltoideus: (A) 1- potenciál motorické jednotky o výbojích na 13-15 Hz; 2- menší jednotka s výbojem na 4 Hz ve stopě 4. Potenciál 1 obsah je složen ze 4 fází, není polyfázický. (B) 2 stopy, myopatie. Jednotlivé potenciály motorických jednotek nerozeznatelné. Kredit: P.E. Barkhaus, MD, 2001.

34. Tetanie

35. Patologická aktivita Ztratí-li svalové vlákno motorickou inervaci, projevují se u něj charakteristické spontánní výboje za klidu. Tyto jednotlivé výboje se nazývají fibrilace a mají charakteristický pravidelný rytmus, nízkou amplitudu (50-300 mV) a krátkou dobu trvání (0,5-1,5 s). Při prvním ohybu křivky se píše zpravidla pozitivní (dolů směřující) výchylka. Pozitivní výchylky a fibrilace jsou abnormální, ale neindikují nějakou specifickou chorobu. Mohou být znakem hyperiritability svalové membrány. Jsou-li v záznamech ze všech 4 končetin a odpovídá tomu i klinický obraz pacienta, mohou být znakem amyotrofické laterální sklerózy (Lou Gherigova choroba). Reinervace m. tibialis anterior

36. Polyfázicita (více než 5 základních linií na EMG) a zvýšená pilovitost („zubatost“) záznamu může být projevem rienervace nebo primárních poruch kosterní svaloviny – myopatií. Nicméně, průvodním znakem většiny myopatií je snížená amplituda záznamu a prodloužená doba akčního potenciálu. Toto je záznam myotonické dystrofie. Familial periodic paralysis Femoral nerve dysfunction Friedreich's ataxia Guillain-Barre Lambert-Eaton Syndrome Mononeuritis multiplex Mononeuropathy Peripheral neuropathy Radial nerve dysfunction Sciatic nerve dysfunction Sensorimotor polyneuropathy Shy-Drager syndrome Thyrotoxic periodic paralysis Tibial nerve dysfunction Ulnar nerve dysfunction Polymyositis Denervation (reduced nervous stimulation) Carpal tunnel syndrome Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) Myopathy (muscle degeneration, may be caused by a number of disorders, including muscular dystrophy) Myasthenia gravis Alcoholic neuropathy Axillary nerve dysfunction Patologická aktivita Distal median nerve dysfunction Duchenne muscular dystrophy Facioscapulohumeral muscular dystrophy (Landouzy-Dejerine) Becker's muscular dystrophy Brachial plexopathy Cervical spondylosis Common peroneal nerve dysfunction Dermatomyositis

37. Mechanismus kontrakce První molekulární teorie svalové kontrakce pocházejí z 30. let minulého století – myslelo se, že myosin se smršťuje (jako pryž) při změně ionizačního stavu. V 50. letech ukázali HE Huxley (Huxley and Hanson 1954) a AF Huxley (Huxley and Niedergerke 1954), že sarkomera obsahuje kromě myosinu i aktin, a že se tyto dva typy vláken posouvají po sobě. S objevem ATPasové aktivity mysoinu se začaly formulovat teorie o molekulových motorech a o dvou konformačních stavech myosinu (Reedy a ost. 1965). Roku 1972 na Cold Spring Harbor Symposium byla prvně formulována teorie klouzavých vláken (sliding filament theory): Huxleyho (1969) resp. Lymn-Taylorův cyklus (1971): (1) Myosin je navázán na aktin pod úhlem 45° v tzv. rigorové pozici. (2) Po navázání ATP dojde k rychlé disociaci aktinu od myosinu. (3) Hydrolýza ATP vede k nastavení myosinu na úhel 90° a znovunavázání na aktin. (4) V posledním kroku je aktin posunut po myosinu (4). Posun aktinu po myosinu byl spočten na 80-100 Å (Huxley and Simmons 1971).

38. Pereira et al., J.Anat. 2001, 198, pp.663-671 Teorie klouzavých filament (SLIDING FILAMENT THEORY Lymn-Taylorův cyklus (1971): myosin je navázán na aktin pod úhlem 45° v tzv. rigorové pozici (1). Po navázání ATP dojde k rychlé disociaci aktinu od myosinu (2). Hydrolýza ATP vede k nastavení myosinu na úhel 90° a znovunavázání na aktin (3). V posledním kroku je aktin posunut po myosinu (4).

39. Mechanismus kontrakce S postupem času a lepšími zobrazovacími technikami se ale ukázalo, že změna úhlu hlavičky a zbytku myosinové molekuly (předpokládaných 45°) je minimální nebo téměř žádná. Teorie klouzavých filament musela být modifikována. Dnes je hodně rošířena tzv. swinging lever arm theory – s modifikacemi, které mění klouzavý model na (zhruba) klouzavě-šroubovicový. Prokázalo se totiž, že myosinová molekula vykazuje spíše pohyby rotační než prostý ohyb v krčku. Struktura aktomysoinového komplexu Vpravo vidíte 5 molekul aktinu stočených v helixu a vlevo mysoinovou hlavičku. Červeně je horní 50 kD doména, bíle dolní 50 kD doména, helixy s SH zbytky jsou bledě (SH2) a tmavě (SH1) modré. Regulační řetězec je fialový.

40. Myosin Myosin byl objeven před více než 100 lety Kühnem (1864). Těžký meromyosin („hlavička“ proteinu) má ATPasovou aktivitu. Hlavička je tvořena 7 b-listy a větším počtem a-helixů, které formují hlubokou štěrbinu. Ta rozděluje hlavičku na tzv. horní 50 kD a dolní 50 kD doménu, které váží aktin. Na opačné straně domén (b-listů) je vazebné místo pro nukleotidy (ATP resp. ADP/Pi komplex). Toto místo obsahuje charakteristickou „P-smyčku“ – tu mají i G-proteiny. Mechanismus hydrolýzy je tedy zřejmě poměrně univerzální. Vazebná místa pro aktin a pro nukleotidy spolu zřejmě přímo komunikují přes štěrbinu, neboť obě zasahují do horní i dolní 50 kD domény. Část hlavičky (a-helix tzv. S1 fragmentu) slouží jako páčka, které se pohybuje a otáčí, i když je zbytek molekuly rigidní. „Pantem“, kterým je tato páčka přichycena ke zbytku molekuly, jsou zřejmě dva thiolové zbytky na konci a-helixu. C-konec hlavičky myosinu („krček“) je tvořen a-helixy a obsahuje např. regulační řetězce. (Na pohybu molekuly není zachyceno rozevírání štěrbiny mezi 50 kD doménami , ani pravděpodobný pohyb v místě kontaktu aktinu s myosinem.) Myosin se skládá z „ocásku“ a dvou „hlaviček“, označovaných také jako tzv. příčné můstky. Ocásek je asi 10x delší než hlavičky. Hlavičky obsahují kromě vazebných míst pro ATP a aktin také dva lehčí, regulační řetězce, které myosin stabilizují a někdy regulují jeho činnost. Obalují těžší řetězec hlaviček.

41. horní raménko50 kD domény dolní část 50 kD domény Myosinová hlavička vazebné místo pro aktin „kapsička“ pro ATP štěrbina KRČEK

42. Mechanismus kontrakce (A) prostorový model myosinových hlaviček ilustruje rotačně-klouzavou představu kontrakce. I když každý myosinový komplex má 2 hlavičky, v daném okamžiku je v činnosti vždy jen jedna. Ve výchozím stavu je ATP/ADP+Pi navázáno na nukleotidové místo hlavičky (tmavomodře) a hlavička není navázána na aktin. V prvním kroku se jedna hlavička spojí s aktinem na specifickém vazebném místě (zeleně). V důsledku toho se uvolní Pi (krok 2). Energie je uvolněna a hlavička (nyní červená se pootočí vzhledem k aktinu (dojde k otevření štěrbiny a spjení dalšího vazebného-akceptorového místa) a působí silou po maličké dráze (koná práci), posunujíc oba typy vláken po sobě. Tuto rotaci způsobují postupné vazby, asi 4. ADP je pak uvolněno z nukeotidového místa a nahrazeno ATP (krok 3), což oslabí aktomyosinové vazby a 50 kD domény hlavičky se navrátí do původní polohy. Zavírá se štěrbina. Hlavička je znovu připravena k vazbě, bude-li přítomen Ca2+. Dřívější znázornění vesla a loďky už příliš nesedí, spíše to připomíná prodírání se hulváta se vztyčenými lokty (o stejném úhlu) davem.

43. Mechanismus kontrakce Myosin se vyskytuje v „otevřené“ - koncové a „zavřené“ - počáteční konformaci. Zavřená (rigorová) konformace je charakterizována nepřítomností nukleotidu a uzavřenou štěrbinou mezi horní a dolní 50 kD doménou hlavičky. V nepřítomnosti ATP se myosin pevně váže na aktin. Po navázání ATP dojde k rychlé disociaci – myosin může ATP a aktin vázat oboje najednou jen velmi přechodně. Bez vazby na aktin je mysosin jen velmi slabou ATPasou. Po navázání ATP (s iontem Mg2+) dojde k rychlé hydrolýze a vzniku komplexu ADP/Pi. Tato změna volné energie vede k uzavření štěrbiny mezi horní a dolní 50 kD doménou hlavičky a mírné rotaci „páčkového“ raménka hlavičky a k uvolnění mysoinu od aktinu. K ještě výraznější rotaci doje po uvolnění komplexu ADP/Pi z myosinu – poté dojde k rotaci asi o 30-35°. Právě toto uvolnění nukleotidu asi působí jako hlavní zdroj konformačních změn. Po uvolnění nukleotidového komplexu dojde opět k velmi silné vazbě na aktin a změně konformace myosinové molekuly. Protože jednou částí (S1 fragmentem) je myosin pevně vázán na aktin, konformační změna vyvolaná uvolněním ADP/Pi vyvolá posuv aktinu po myosinu asi o 12 nm. K nepatrné rotaci může dojít i v oblasti „regulačního“ řetězce myosinové molekuly. Tato rotace je velmi malá, ale vzhledem k tomu, že do jedné kontrakce je zapojeno asi 10-20% ze všech přítomných příčných můstků, může v součtu i tato malá rotace přispívat k celkové změně konformace kontraktilního aparátu velmi výrazně.

44. Pohled na vazebné místo na hlavičce myosinu (směrem od aktinu) P-smyčka: zeleně; komplex Mg/ATP: basí otočená dozadu, uhlíky žluté, dusíky modré, fosfát bledě modrý, kyslík červený, hořčík zelený; 50 kD doména červeně, má S1 a S2 fragment měnící konformaci při navázaném ATP (bílé) a po hydrolýze na ADP/Pi. Bledě modrá je „osa otáčení“ (helix s AA zbytky 648-666) – okolo ní rotují fragmenty 50 kD domény. Všimněte si konservovaného glycinu (Gly466) – podle toho, je-li ATP před hydrolýzou nebo po ní, mění polohu a rotuje asi o 5 Å.

45. Co si pamatovat z dnešní přednášky • oko: stavba, polarita • ERG: princip, typy elektrod, využití • standardní ERG křivka: popis, interpretace • EOG: princip, poměr amplitudy světlo/tma a jeho diagnostický význam • struktura lidské sítnice • komunikace fotoreceptorů a horizontálních buněk • zpětnovazebné regulace pomocí horizontálních buněk • EMG: princip, využití, příklady patologického záznamu • (mechanismus kontrakce)