Green Fluorescent Protein (GFP)

1. Green Fluorescent Protein (GFP) • Das GFP ist ein Protein von • 238 Aminosäuren ursprünglich • aus der Qualle Aequoria victoria • isoliert. • Diese erzeugt grüne • Biolumineszenz. • Das Protein kann in jedem • Organismus ohne zusätzliche • Cofaktoren exprimiert werden.

2. Anwendungen von GFP • In vivo Verfolgung von Proteinen • Aufzeichnung von Gen Expressionen • Beobachtung von Zellpopulationen bzw. Differenzzierung • Studium von Infektionen

5. Struktur des GFP • Die Struktur von GFP zeigt eine Form die an eine Kanne erinnert. Sie wird als “β-Can” bezeichnet • Dies besteht aus 11 β-Faltblättern und einer zentralen α-Helix

6. Fluorophor • Fluorescenz wird durch einen Fluorophor erzeugt welcher im Zentrum des Proteins sitzt.

7. Die Struktur des Fluorophors • Der Fluorophor entsteht in einem Tripeptide -Ser65-Tyr66-Gly67- • Dessen Bildung geschieht auto-katalytisch

8. Mechanismus der Fluorophor-Bildung Durch Ringbildung entsteht ein konjugiertes aromatisches System.

10. Was ist Fluorescenz? • Ein Molecül absorbiert ein Photon und hebt es auf eine höhere Schale (Energielevel). • Nach 10-9 to 10-4 Sekunden fällt das Elektron auf die Ausgangsschale (Energie-level) zurück und emittiert ein Photon. • Das emittierte Photon hat eine geringere Energie (größere Wellenlänge) als das absorbierte. • Konjugierte und aromatische Syteme zeigen oft Fluorescenz

11. Spektrale Charakteristik des wild-Typ GFP • Anregungsmaximum bei 395 nm (UV) mit einem kleinen peak bei 475 nm (blau) • Emission bei 508 nm (grün) • Quantenausbeute zwischen 0.72 to 0.85

12. Bedeutung von Wasserstoffbrücken zur Fixierung des Moleküls • Der isolierte Fluorophor fluoresziert nicht. • H-Brücken zu nahegelegenen Seitenresten erzeugen erst Fluorescenz

14. Mutationen führen zu blauen und roten fluoresierenden Proteinen • Ser65 nach Thr • Phe64 nach Leu • Tyr66 nach His • Tyr145 nach Phe