Formål

1. Formål - at forstå det eksperimentelle grundlag for moderne molekylærbiologisk/genteknologisk arbejde -at kunne bruge dette grundlag til at tolke virkelige molekylærbiologiske data taget fra den videnskabelige litteratur - at kunne bruge dette grundlag til at designe molekylærbiologiske experimenter til belysning af biologiske problemstillinger - at give en dybgående behandling af den makromolekylære syntese og dennes regulering

2. Eksamensrelevansen af dette er: • At dette ikke er et fag man består ved at kunne lærebogen uden af (tværtimod) • Derimod består man ved at forstå, læs og forstå derfor de originale eksperimenter som lærebogen er rig på i de enkelte afsnit. Forstå hvad de viser og hvorledes samme teknik generelt kan bruges • Sørg for at i forstår problemstillingerne og løsningerne på de opgaver vi gennemgår hver onsdag eftermiddag • Erfaringsmæssigt oplever de studerende problemorienterede opgaver som svære • Fortvivl ikke hvis opgaverne virker svære når i forbereder jer hjemme. Det vigtige er, at forstår dem efter regnetimerne

3. Restriktions enzymer (restriktions endonukleaser)

4. Restriktions enzymer genkender og binder en bestemt nukleotid-sekvens og spalter DNAet. Kan deles op i tre typer. Type I binder til en bestemt DNA sekvens, men skærer et tilfældigt sted derfra. Type II binder og skærer samme sekvens. Type III binder og skærer også samme sekvens. Type II enzymer vi bruger i laboratoriet.

5. Restriktionsenzymer navngives efter den bakterie hvorfra de oprindelig er isoleret Sædvanligvis har de et navn på tre bogstaver, det første fra genus og de næste to fra species navnet. Nogle gange har enzymer et fjerde bogstav som refererer til den specifikke stamme enzymet oprindeligt er fundet i. De første tre bogstaver af enzymnavnene skrives altid med stort. F.eks. SmaI, Serratia marcescens EcoRI, Escherichia coli PstI, Providencia stuartii

6. Type II enzymer genkender og spalter som regel en 4, 6 eller 8 nukleotider lang sekvens af dobbeltstrenget DNA. Nogle skærer DNAet lige over (blunt end skæring). F.eks. SmaI, 5’ CCCGGG 3’ 3’ GGGCCC 5’ . 5’ CCCOH 3’ 5’ pGGG 3’ 3’ GGGp 5’ 3’OHCCC 5’

7. Nogle skærer DNAet så det giver 5’ overhang EcoRI: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ GOH3’ 5’ pAATTC 3’ 3’ CTTAAp 5’ 3’OHG 5’

8. Nogle skærer med 3’ overhang Pst I: 5’ CTGCAG 3’ 3’ GACGTC 5’ 5’ CTGCAOH 3’ 5’p G 3’ 3’ Gp 5’ 3’ OHACGTC 5’

9. http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.aspNew England Biolabs, den største leverendør af restriktionsenzymer

10. Hvor skærer restriktionsenzymerne i et givet stykke DNA ? Der findes diverse freeware på nettet bl.a. webcutter2 http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

11. atgtct aaaggtgaag aattattcac tggtgttgtc ccaattttgg ttgaattaga 121 tggtgatgtt aatggtcaca aattttctgt ctccggtgaa ggtgaaggtg atgctactta 181 cggtaaattg accttaaaat ttatttgtac tactggtaaa ttgccagttc catggccaac 241 cttagtcact actttcggtt atggtgttca atgttttgct agatacccag atcatatgaa 301 acaacatgac tttttcaagt ctgccatgcc agaaggttat gttcaagaaa gaactatttt 361 tttcaaagat gacggtaact acaagaccag agctgaagtc aagtttgaag gtgatacctt 421 agttaataga atcgaattaa aaggtattga ttttaaagaa gatggtaaca ttttaggtca 481 caaattggaa tacaactata actctcacaa tgtttacatc atggctgaca aacaaaagaa 541 tggtatcaaa gttaacttca aaattagaca caacattgaa gatggttctg ttcaattagc 601 tgaccattat caacaaaata ctccaattgg tgatggtcca gtcttgttac cagacaacca 661 ttacttatcc actcaatctg ccttatccaa agatccaaac gaaaagagag accacatggt 721 cttgttagaa tttgttactg ctgctggtat tacccatggt atggatgaat tgtacaaata 781 a

12. Restriktionsenzymer forekommer sammen med et modifikationssystem for at undgå fordøjelse af bakteriens eget DNA Modifikationsenzymerne er methylaser, som methylerer nukleotider i restriktionssitet Modifikation af den ene DNA streng nok til at forhindre nedbrydning (ellers ville bakterien få problemer under DNA replikationen) Dette har den praktiske betydning, at man skal vælge en E. coli stamme, der er restriktions-negativ, når man ønsker at introducere DNA fra en anden organisme eller anden E. coli stamme for at undgå fordøjelse af DNAet. Type I og III’s nuklease aktivitet sidder i samme protein som methyleringsaktiviteten For Type II enzymer er aktiviteterne adskilt i forskellige proteiner

13. For at DNA stabilt kan opretholdes i en voksende bakterie-population er det essentielt at • - det kan replikeres • at det fordeles effektivt mellem moder og dattercelle • stabil opretholdelse af DNA fragmenter fra en anden organisme må derfor sikres ved at DNA fragmentet ”sættes sammen med” DNA som har de to ovennævnte egenskaber • dette DNA benævnes en ”vektor” og er typisk enten et plasmid eller en virus/bakteriofag • plasmider er naturligt forekommende, autonomt replikerende cirkulære stykker DNA som bibringer bakterien en selektiv fordel i forskellige miljøer (f.eks. antibiotika resistens) • in vitro fremstillede varianter af naturligt forekommende plasmider og bakteriofager.

17. Hvordan får vi DNAet ind i E. coli igen ? Det ligerede DNA introduceres i en E. coli stamme ved transformation (hvis et plasmid) eller ved transduktion (hvis en bakteriofag) For at E. coli kan optage DNA skal cellerne gøres kompetente ved behandling med CaCl2 eller ved at cellerne udsættes for et kraftigt elektrisk felt i tilstedeværelse af DNA (elektroporation)

18. Hvordan får man fat på en bestemt genomisk eller cDNA klon ? Med en klon vil vi forstå en bakterie der indeholder en vektor med et bestemt stykke genomisk/cDNA Fremstilling af genom og cDNA biblioteker Screening af genom- og cDNA biblioteker Ekspressionskloning Komplementation i mikroorganismer Subtraktionskloning Microarray Differential display

19. Konceptet er at få indsat genomsekvenser eller cDNA sekvenser i en vektor på den mest effektive måde, så alle sekvenser i genomet/alt mRNA er repræsenteret i biblioteket. Biblioteker fremstilles næsten altid i E. coli En vigtig faktor er her introduktion af DNAet i E. coli. (plasmider transformeres, bakteriofager transduceres)

20. Hvor stort skal et bibliotek være for at alle sekvenser er med ? N = ln(1-P)/ln(1- 1/n) N = antal kloner i biblioteket P = sandsynligheden for at en given sekvens er med i biblioteket n = genomets størrelse divideret med den gennemsnitlige fragmentlængde i biblioteket data er fra fremstiling af et genombibliotek fra mus N =ln(1-0.95) ln(1- 1/2.6 106kb/20 kb) N = 4.2 105

21. Når man skal fremstille et repræsentatitvt bibliotek er det vigtigt at alle parametre er optimerede En af de vigtige parametre er introduktion af det rekombinante DNA ind i E. coli. Her kan man benytte sig af at bakteriofager fra naturens side er selekteret til at inficere deres værtsorganisme yderst effektivt Rekombinante bakteriofager har således en evne til at introducere DNA, med en mellem 10 og 100 gange højere effektivitet end transformation med plasmid DNA

22. EM billede af lambda Hoved hvori DNA er pakket Halen Halefibre

23. Strukturen af vild type lambda Lineært dobbeltstrenget DNA med 12 nukleotiders overhang i 5’ enderne (COS sites[cohesive ends])

24. Lambda livscyklus lysogen cyklus lytisk cyklus

25. Livscyklus af lambda

26. lambda plaques på et tæppe af E. coli der opstår lyse områder der, hvor lambda fagen har lyseret (sprængt) værtscellen

29. Krav til størrelsen af lambda for at den kan pakkes i faghoveder. fra 75% til 105% af vildtypens størrelse

30. En vild type lambda kan ikke gro på en E. coli stamme der er lysogen for bakteriofagen P2 En lambda der mangler rekombinationsgenerne red, gam kan derimod godt gro på en P2 lysogen stamme Erstattes red gam regionen med ”fremmed” DNA kan den rekombinante fag gro på en P2 lysogen stamme Spi fænotypen Spi = sensitive to P2 inhibition red, gam

31. To typer lambda vektorer Replacement vektorer Insertion vektorer

32. Vigtigt at der findes unikke restriktionssites i lambda til at klone genomisk eller cDNA . Vigtigt at rekombinante fager nemt kan skilles fra ikke rekombinante, da det ellers er svært at se, hvor stor biblioteket reelt er Nemt at flytte DNA fra lambda fagen til et plasmid Mulighed for in vitro transkription

33. Replacement vektoren l-EMBL3

34. Replacement vektoren l-DASH Op til 25 kb ”fremmed” DNA

35. Strukturelt kort over insertionsvektoren l ZAPII op til 10 kb cDNA

36. Insertions vektoren l ZAP express

37. Strukturen omkring MCS i l-ZAP express Tillader ekspression af klonet cDNA i mammale celler og i E. coli. Blå/hvid screening på X-GAL plader

38. Strukturels kort over insertionsvektoren l ZAP-CMV

39. Plaques af lamda med b-galactosidase aktivitet Stoffet X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galctopyronoside) laver en blå udfældning når det spaltes af b-galactosidase. Plaques eller kolonier med b-galaktosidase aktivitet er således blå, medens plaques uden aktivitet er hvide

40. Strukturelt kort over Cosmidet SuperCos Ori, E.coli replikations origin NeoR, resistens gen mod neomycin (G418) SV40 ori, origin fra SV40 virus Cos, cos sites til pakning i l hoveder T3/7, T3/7 promotorer til in vitro transkription op til 50 kb fremmed DNA

41. Strukturelt kort over et BAC plasmid CmR, gen der giver resistens mod kloramfe-nikol OriS, replikations-origin fra F plasmidet repE, replikations- initiering ParA/B partitioning gener der sikrer effektiv plasmid segregering op til 300 kb

42. Strukturelt kort over YAC vektoren pYAC4 CEN4, centromer SUP4, tRNA der supppreserer ade2 mutation i gær. Inaktivering af SUP4 gør gæren rød. TEL, telomerer fra Tetrahymena. Skæres med BamHI og EcoRI og ligeres til EcoRI skåret genomisk DNA op til 1 million kb Reeves et al (1992) Methods. Enzymol. 216, 584-603

43. Hvordan får vi fremskaffet definerede overlappende genomiske DNA fragmenter ? Vi vil gerne have sekvensen af sammenhængende stykke genomisk DNA Løsningen er at skære DNAet partielt (ufuldstændigt) med et enzym der skærer ofte, typisk Sau3A (5’ GATC 3’) Sau3A genererer ender der kan ligeres til BamHI skåret vektor DNA

44. Sau3A genkendelsessites Hvis vi skærer DNAet med lidt Sau3A i så kort tid, at vi får genereret fragmenter mellem 14-20 kb vil vi få en række forskellige overlappende fragmenter ud af det. Kan vi bestemme sekvensen af de overlappende fragmenter, kan vi sammenstykke sekvensen af hele området.

45. cDNA syntese mRNA oprenses på en affinitetssøjle med polydT eller polyU Kræver enzymet revers transkriptase der fremstiller en DNA kopi af mRNA Revers transkriptasen kræver en ”primer” (et 15 – 25 nukleotider langt stykke DNA eller RNA) for at kunne starte cDNA syntesen Kræver dNTP (de-oxy-nukleotid trifosfater) og de rigtige fysisk-kemiske forhold Nogle revers transkriptaser har aktivitet ved 55-60oC, hvilket er en fordel, hvis mRNA har meget sekundær struktur Som primere kan anvendes polydT som annealer til polyA halen på mRNA eller random hexamerer (en blanding af alle 26 mulige hexamerer) eller en mRNA specifik primer.

46. Indkorporering af syntetisk DNA i enderne af cDNAet Mulighed for kloning i bestemt orientering Methyleret dCTP forhindrer skæring i insertet

47. Homopolymer tailing af cDNA

49. Screening af biblioteket kræver noget information om det gen man ønsker at klone (eller information om en del af det protein man ønsker at klone genet for)

50. Screening med en probe Screening med et antistof