BAKTERİYOFAJLAR

1. BAKTERİYOFAJLAR Prof.Dr.Ömer POYRAZ

2. BAKTERİYOFAJLAR • Bakteri virüsleri olarak da bilinen bakteriyofajlar, bakterilerin zorunlu parazitleri olup, yalnızca canlı bakteri hücreleri içinde çoğalabilirler. • Bakterilerle olan ilişkileri sonucunda çoğu zaman bakterilerin parçalanarak erimesine yol açarlar. • Bakteriyofajlar genellikle belirli tür veya belirli tip bakterilere karşı özgül ilişki gösterirler. • Yani bir bakteriyofaj tipi yalnızca kendisine uygun olan bakteri türünü enfekte edebilir. • Bunun yanında bir tür bakteri, birden çok bakterinin üremesi için konak vazifesi görebilir. • Üzerinde en fazla çalışılan fajlar E.coli, B.subtilis ve Pseudomonas’lara ait fajlardır.

3. Yapısal Özellikleri • Çeşitli tipte ve görünümde fajlar bulunmakta olup, kompleks bir fajda baş, boyun, kuyruk ve kuyruk fibrilleri bulunmaktadır. • Baş kısmı yaklaşık 80x110 nm boyutlarındadır • Baş kısmının ortasında nükleik asitten oluşmuş bir faj genomu vardır. • Nükleik asit tipi fajların çoğunda DNA, az bir kısmında ise RNA' dan oluşmaktadır. • Nükleik asitler virüslerde olduğu gibi tek veya çift iplikcikli olabilirler. • Nükleik asidin etrafında ise yine virüslerde olduğu gibi kapsit adı verilen protein bir kılıf bulunur. • Nükleik asit ve kapsidten oluşan bu yapıya nükleokapsid adı verilir.

4. Yapısal Özellikleri • Fajlarda baş kısmını kuyruk kısmına bağlayan kısa bir boyun kısmı bulunur. • Kuyruk yapısı bakteriyofaj tiplerine göre farklılıklar gösterir. • Bazı faj türlerinde hiç kuyruk bulunmazken, yani yalnızca baş kısmından oluşurken, bazılarında çok kısa ve basit yapılar şeklinde, bazılarında ise oldukça kompleks görünümde olabilirler. • Kompleks bir fajın kuyruğunun yüzeyinde kasılabilir örtü ve kuyruğun alt kısmında ise taban organeline bağlı olarak bulunan kuyruk fibrilleri yer alır. • Kuyruk yaklaşık 25x110 nm boyutlarındadır. • Kuyruk kısmı bakteriyofajlarda yapışma veya adsorbsiyon organeli olarak görev yapar. • Genetik maddenin bakteriye transferinde bir kanal ya da köprü vazifesi görür. • Kuyruk kılıfının kasılması sayesinde genetik madde kuyruk içerisinden bakteriye nakledilir

5. Kompleks Bir Fajın Şematik Görünümleri

6. Bakteriyofajların Elektron Mikroskopundaki Görünümü

7. Fajların Sınıflandırılması • Elektron mikroskopla yapılan çalışmalarda bakteriyofajların morfolojik yapıları hakkında ayrıntılı bilgiler elde edilmiştir. • Bu amaçla genellikle E.coli’’ye ait fajlardan yararlanılmıştır. • Bakteriyofajlar morfolojik ve diğer karakter-leri göz önüne alınarak çeşitli sınıflandırmalara tabi tutulmuşlardır. • Bunlardan en önemlileri Bradley ve Ackermann sınıflandırmasıdır.

8. Bradley Sınıflandırılması • Bu sınıflamaya göre fajlar baş ve kuyruk özelliklerine göre 6 grup altında toplanırlar. A tipi faj : Kasılabilen kılıflı, kuyruklu fajlar. B tipi faj : Uzun kuyruklu, kılıflı fajlar. C tipi faj : Kısa kuyruklu, kılıfsız fajlar. D tipi faj : Kuyruksuz, büyük kapsomerli fajlar. E tipi faj : Kuyruksuz, küçük kapsomerli fajlar. F tipi faj : Başsız, ipliksi ya da filamentöz fajlar.

9. A Tipi Faj • Tam kompleks fajlar bu grupta yer alır. • Bunlarda baş, kuyruk, etrafında kasılabilir kılıf, kuyruk tabanı, kuyruk fibrilleri gibi organeller bulunur. • Baş kısmında çift iplikçikli ve lineer DNA molekülü yer alır.

10. B Tipi Faj • Bu fajlarda uzun kuyruğun etrafında kasılabilir kılıf bulunmaz • Baş kısmı içinde çift iplikçikli lineer bir DNA molekülü vardır. • Kuyruğun distal ucunda taban organeli, iğne, fibril gibi organeller bulunmaz

11. C Tipi Faj • Baş kısmı tip A ve tip B’ye benzer • Bunlarda kasılabilir kılıfı olmayan kısa kuyruk bulunur • Baş kısmında çift iplikçikli lineer DNA molekülü bulunur • Kısa olan kuyruğun distal olan ucunda taban organeli, iğne ve fibril bulunmaz

12. D Tipi Faj • Bu gruptaki fajlar kuyruksuz olup ikozahedral simetri yapısı gösterirler. • Kapsidlerinde bulunan kapsomerler büyüktür. • Kendileri ise çok küçük olup (25 nm ), tek iplikçikli çembersel DNA molekülüne sahiptir.

13. E Tipi Faj • Bu gruptaki fajlar morfolojik olarak tip D’ye benzerler • İkozahedral simetri yapısı gösterirler. • Kapsidlerinde bulunan kapsomerler küçük boyuttadır. • Yapısındaki nükleik asit RNA olup, tek iplikçikli, linear yapıdadır.

14. F Tipi Faj • İpliksi yapıda fajlar olup, baş ve kuyruk gibi organelleri bulunmaz. • Tek iplikçikli lineer DNA ihtiva eder.

15. Ackermann Sınıflandırması • Bu sınıflandırmad morfolojik karakter-leri yanında diğer bazı özellikler de dikkate alınır. • Buna göre fajlar 4 temel gruba ayrılır 1 – Kuyruklu fajlar 2 – Kübik simetrili fajlar 3 – Flamentöz fajlar 4 – Pleomorfik fajlar

16. Fajların Serolojik Özellikleri • Fajlar antijenik yapıda olup, antifaj serumlar tarafından nötralize edilirler • Fajların bu karakterleri ile konak bakterinin antijenik özellikleri arasında bir ilişki yoktur. • Fajlar yapı özellikleri nedeniyle antijenik yönden birbirinden farklıdırlar. • Buna rağmen bazı fajlar arasında çapraz reaksiyonlar olabilir • Bir faj yapısında antijenik farklı moleküller bulunabilir. • Bunlar fajın farklı bölgelerine yönelik hazırlanan antiserumlar ile birleşirler. • Genelikle baş ve kuyruk proteinleri farklı antijenik molekül içerirler. • Antifaj serumlar faj partiküllerini aglutine ederken, yüzeylerinde faj adsorbe eden bakteriler de aglutine olurlar

17. Çoğalmaları • Bakteriyofajlar konak bakteri yönünden oldukça seçicidirler. • Her fajın içinde çoğalabileceği spesifik bir bakteri konağı bulunur. • Bakteriyofajların da virüslerde olduğu gibi çoğalma safhaları bulunur. • Bunlar adsorbsiyon, penetrasyon, bakteri içinde gelişme dönemi, olgun fajların meydana gelmesi ve fajların serbest kalması safhalarıdır.

18. Adsorbsiyon • Bu dönem fajın bakteri yüzeyine tutunduğu yani, bakteri içine girmek için yapıştığı dönemdir. • Fajların bakteriye bağlanması kuyruklu olanlarda kuyruklarla, diğerlerinde ise fajın yüzeyindeki reseptörlerle sağlanır. • Bir bakteri yaklaşık 300 kadar fajı yüzeyine adsorbe edebilir. • Bu bağlanma konak bakterinin fizyolojik durumuna ve fajın türüne göre değişebilir. • Aktif üreme döneminde olan çoğu bakteriler fajları daha fazla düzeyde adsorbe ederler. • Buna karşın bazı fajlar bakterilerin üremelerinin durma döneminde daha etkilidirler. • Bakteri yüzeyinde bulunan pilus, teikoik asit, flagella, lipoprotein, protein, lipopolisakkarit molekülleri ve hücre duvarının diğer bazı bölgeleri faj adsorbsiyon noktaları ya da reseptörleridir.

19. Adsorbsiyon • Kuyruklu fajlar kuyruklarındaki fibriller, kuyruk iğneleri ve kuyruk tabanı ile adsorbe olurlar. • Bu bağlanmada önce fibriller, sonra iğneler ve kuyruk tabanı bakteriye tutunur. • Kuyruksuz olanlar veya ipliksi fajlar bakteriye direkt temasla adsorbe olurlar. • Bakteri yüzeyindeki faj reseptör bölgeleri kendi fajı ile antijenik ilişkiye sahip olduğundan ancak kendisine bu yönden homolog olan fajları adsorbe edebilirler. • Bu durum gerek bakteri gerekse faj tiplendirmesinde işe yarar. • Adsorbsiyonun ilk basamağında bakteri yüzeyi ile faj arasındaki ilişki geriye dönüşümlüdür. • Adsorbsiyondan sonra zaman geçtikçe bu bağlanma kuvvetlenerek geriye dönüşümsüz hale gelir.

20. Adsorbsiyon • Bakterilerin yüzeyel antijenik yapısı ile faj adsorbsiyonu arasında çok sıkı bir ilişki vardır. • Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde bu yüzey antijenik özellikleri farklı olduğu için fajları da farklıdır. • Bakterilerin yüzeyel yapıları Vi antijenleri, kapsül antijenleri ve mukoid tabaka ile örtülü olabilir. • Mukoid tabaka ve kapsül yapıları genellikle faj adsorbsiyonuna engel olurlar. • Bazı fajlarda bulunan depolimerizan enzimler kapsülü ayrıştırabilir ve adsorbsiyonu kolaylaştırabilirler. • Yüzeylerinde özel reseptörleri olmayan veya bu reseptörleri sentezlemeyen mutant bakteriler spesifik fajlara karşı dirençlidirler.

21. Adsorbsiyon Aşamasının Görünümü

22. Penetrasyon • Adsorbsiyondan kısa bir süre sonra faj nukleer materyali hücre içine enjekte edilir. • Bakteri yüzeyine adsorbe olan fajların nukleer materyali çeşitli şekillerde bakteri hücresi içine enjekte edilirler. • Kasılalabilir kılıflı kuyruklu fajlarda kuyruk etrafındaki kılıf kasılarak kuyruk kısmının hücre duvarına girmesini sağlar. • Bu sayede nukleik asitlerini sitoplazmaya enjekte ederler. • Kapsid içindeki genetik materyal kuyruk içindeki kanaldan geçerek periplazmik boşluğa gelir ve buradan kısa süre sonra stoplazmaya geçer. • Açılan delik bakteri tarafından hemen tamir edilir. • Kapsid ve kuyruk dışarıda kalır, içeri giremez. • Diğer fajlarda ise nukleik asit kısmı bakteri içerisine özel bir mekanizmayla, kapsit kısmı dışarıda kalacak şekilde girerler.

23. Adsorbsiyon ve Penetrasyon Mekanizmasının Şematik Görünümü

24. Bakteri İçinde Gelişme Dönemi • Bu dönem fajı oluşturacak çeşitli yapıtaşlarının sentezlendiği dönemdir. • Bu dönemde baş, kuyruk ve diğer faj yapıları oluşur. • Yani tam olarak faj yapısı meydana gelir. • Latent dönem olarak da adlandırılan bu dönem fajların genetik materyallerinin bakteri sitoplazmasına girmesinden olgun fajların oluşumuna kadar geçen süreyi içine alır. • Bu dönemde ilk önce faja ait yapıtaşları ayrı ayrı sentezlenir. • Faja ait nükleik asit kısmı replike olur. • Daha sonra ayrı ayrı sentezlenen bu yapı taşları bir araya gelerek olgun faj partiküllerini meydana getirir.

25. Bakteri İçerisinde Oluşan Fajların Serbest Hale Geçmesi • Bakteri içerisinde bol miktarda gelişen ve olgunlaşan fajlar belirli bir sayıya ulaştıktan sonra bakterilerden çıkarak serbest hale gelirler. • Serbest hale geçen fajlar, yeni bakterileri enfekte ederek hayat sikluslarını devam ettirirler. • Bakteriyofajların serbest hale gelmesi bakteriyofajların enfeksiyon tiplerine göre farklılık gösterir.

26. Faj Enfeksiyon Tipleri • Fajlar duyarlı bakterilerde genellikle 2 tür enfeksiyona neden olurlar. 1 – Litik enfeksiyon 2 – Nonlitik enfeksiyon • Persistent enfeksiyon • Lizojenik enfeksiyon

27. Litik Enfeksiyon • Bu tür çoğalma sonucunda bakteri hücreleri genellikle parçalanarak erirler. • Yani lizise uğrayarak ölürler. • Litik enfeksiyonlarda konak bakterinin erimesi ve fajların serbest hale geçmesinde faj genomunda kodlanan spesifik litik enzimlerin önemli fonksiyonları vardır. • Bu enzim sayesinde fajlar belirli bir sayıya ulaştıktan sonra hücre duvarını eriterek serbest hale gelirler. • Her bir litik siklusta yaklaşık 300-400 yeni faj oluşur.

28. Nonlitik enfeksiyon • Nonlitik enfeksiyonlarda bakterilerde lizis meydana gelmez. • Bu tür çoğalma sonucunda bakteri canlılığını kaybetmez. • Yani bakteri içinde faj çoğalması bakterinin canlılığını ve çoğalmasını etkilemez. • Bu yüzden bu tür fajlara bakterilerin yaşamlarını etkilemediği için temperate ya da ılımlı faj adı verilir. • Olgun fajlar hücrede gelişimini tamamladıktan sonra hücre duvarından dışarı çıkarlar. • Bakterilerde hiçbir değişiklik olmaz ve bakteriler normal yaşamlarına devam ederler. • Nonlitik enfesiyonlar 2 şekilde oluşur 1 – Persisten Enfeksiyon 2 - Lizojenik Enfeksiyon

29. Persisten Enfesiyon • Konak bakteri sitoplazmasında bulunan faj bağımsız replikasyona uğramaz. • Bakterinin her bölünmesinde faj da replike olarak yavru bakteriye aktarılır. • Bu şekilde faj bakteri içerisinden çıkmaksızın nesilden nesile aktarılarak canlılığını sürdürür. • İçinde bulundukları bakterilere zararları bulunmaz

30. Lizojenik Enfesiyon • Bazı fajlar bakteri içine girdikten sonra faj DNA’sı bakteri DNA’sı ile entegre hale gelir • Bu şekilde DNA' sı ile bütünleşmiş faj taşıyan bakteriye lizojen bakteri adı verilir. • Bu olaya lizojeni, bağlanan faja da profaj adı verilir. • Lizojenik bakteriler de diğer bakteriler gibi çoğalırlar ve hayati fonksiyonlarını devam ettirirler. • Böylece bir lizojenik bakteriden iki yavru lizojenik bakteri meydana gelir.

31. Bakteriyofaj Enfeksiyonunun Şematik Görünümü

32. Bakteriyofajların Bulundukları Yerler ve İzolasyonları • Bakteriyofajlara genellikle bakterilerin bulunduğu her yerde rastlanır • Bu nedenle sindirim sisteminde, dışkıda, lağım sularında, derelerde, göllerde, gübreli topraklarda ve deniz sularında bolca rastlanır. • Buralardan kolaylıkla izole edilebilirler. • Diğer bir faj kaynağı ise profaj taşıyan lizojenik bakterilerdir. • Faj izolasyonu için özellikle dışkı ve dışkı ihtiva eden sıvılar çok uygundur.

33. Dışkıdan Faj İzolasyonu • Dışkıdan bir miktar alınarak sıvı besiyerine ekilir ve homojenize edilir. • Kültür sıvısı santrifüj edildikten sonra üst sıvı alınarak 0.2 um çapındaki filtrelerden süzülür. • Bakteriler bu filtreyi geçemez, fajlar ise geçerler. • Fajın varlığı katı besiyeri üzerinde üretilen çeşitli bakteri kültürleri üzerine süzülen bu sıvıdan damlatılarak tesbit edilir. • Filtrat damlatılan yerlerde erime olması faj varlığını gösterir. • Lizojenik fajların izolasyonunda ise daha özel teknikler vardır. • Lizojenik faj araştırılacak sıvı genellikle UV ışınlarına maruz bırakıldıktan sonra bakteri kültürleri üzerine ekimleri yapılır. • Erime plakları görülmesi faj varlığını gösterir.

34. Faj Üremesinin Gözlenmesi • Faj üremesinin gözlenmesi üremekte olan bakteri kültürleri üzerine faj içeren sıvıdan ekimler yapılarak olmaktadır. • Bu da iki şekilde yapılabilmektedir. 1 – Sıvı besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi 2 – Katı besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi

35. Sıvı besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi • Sıvı besiyerine önce bilinen bakteriden ekilir. • 37 oC ' de 4-5 saat inkübe etmek suretiyle bakterinin bir miktar üremesi sağlanır. • Hafif bir bulanıklık elde edildiğinde, bu bakteri kültürü üzerine, bakteriye özgül faj ihtiva eden solüsyondan belirli bir miktar ekilir ve karıştırılır. • 37 o C' de 8-10 saat inkübe edilir. • Bu süre sonunda faj üremesine bağlı olarak bakteriler lizise uğrarlar. • Buna bağlı olarak da normalde bulanık olan kültürün görünümü berraklaşır.

36. Katı Besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi • Bu amaçla katı besiyeri üzerine tüm yüzeyi kaplayacak şekilde bilinen bakteri süspansiyonundan ekilir. • 4 - 5 saat süreyle 37 0C' de inkübe edilir. • Bu süre içinde ekilen bakteriler üremeye başlarlar. • Daha sonra besiyeri üzerine belli bir miktar faj solüsyonundan damlatılır ve bütün yüzeye yayılır. • 37 oC' de bir gece inkübe edilir. • İnkübasyon sonunda faj ekilen bölgelerde, bakteri erimesine bağlı olarak yuvarlak plakların oluştuğu görülür. • Bunlara faj plakları adı verilir. • Her bir faj düştüğü alandaki bakterileri eriterek plak oluştururlar. • Eğer çok sayıda faj düşmüşse, faj üremesine bağlı olarak tüm alanlarda bakteri erimesi gözlenir. • Bu durumda faj plakları gözlenemez. • Faj plakları 10-15 mm büyüklüğünde olabileceği gibi, gözle zor görülecek kadar küçük de olabilirler.

37. Bakteriyofajların Sayılması • Tek tek düşmelerini sağlamak amacıyla faj süspansiyonu sulandırılarak, duyarlı bakteri bulunan katı besiyerlerine ekilir. • Uygun inkübasyondan sonra oluşan faj plakları sayılır. • Daha sonra ekilen miktar ve fajın sulandırım oranlarından faydalanılarak faj ihtiva eden süspansiyonun mm3' deki faj sayıları hesaplanabilir.

38. Bakteriyofajların Kullanım Yerleri • Bakteriyofajlar en yaygın olarak bakterilerin tip tayininde kullanılır. • Bu ise epidemiyolojik araştırmalarda önemlidir. • Bakteriyofajlar ancak belirli tür bakterilere ve bu türler içindeki belirli suşlara etki ederler. • Bu şekilde eldeki bilinen fajları mevcut bakterilerle deneyerek, bakterileri tiplendirmek mümkündür. • Antibiyotikler geliştirilmeden önce Salmonella, Shigella, E coli, Vibrio cholera ve Stafilokok enfeksiyonlarında fajlar tedavi maksadıyla kullanılmakta idi. • Antibiyotiklerin kullanıma girmesiyle artık bu tedavi yöntemi kullanımdan kalkmıştır. • Günümüzde fajlardan genellikle rekombinant DNA teknolojisinde yararlanılmaktadır. • Rekombinant DNA teknolojisinde genellikle fajlar aracı(vektör) bir molekül olarak kullanılmaktadır. • Bazı önemli genetik bilgiler fajlara entegre edilerek duyarlı bakteriye verilirler. • Bu sayede bakterilere istenilen genlerin ekspresyonu sağlanmış olur.