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J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5

Inserm Institut national de la santé et de la recherche médicale. . Le point sur les transporteurs et leur impact dans le développement cinétique du médicament. J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5.

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J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5

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  1. Inserm Institut nationalde la santé et de la recherche médicale  Le point sur les transporteurs et leur impact dans le développement cinétique du médicament J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5

  2. TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUEETAT DES CONNAISSANCES EN 1987Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 "Drug transport in the intestine occurs mainly by diffusion".... " Intestinal drugs carriers contribution seems to be of minor importance." "The liver is the organ where carrier-mediated drug transport predominates" Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

  3. TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUEETAT DES CONNAISSANCES EN 1987Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 Four hypothetical carrier systems for hepatocellular drug uptake Carrier 1 Carrier 2 Carrier3 Carrier4 "bile acid carrier" "organic anions" "organic cations" BilirubinBromosulphophtaleinANSIndocyanine green MorphineNalorphine Bile acidsEstronesulfateEstradiol glucuronide Ouabain Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

  4. PepT1 MCT1 MDR1 TRANSPORTEURS ET ADME EN 1996 A. TSUJI, Carrier-mediated Intestinal Transport of Drugs, Pharm. Res., 1996 Absorption et sécrétion intestinales

  5. MDR1 TRANSPORTEURS RENAUX EN 1997 K.j. ULLRICH, Renal transporters for organic anions and organic cations, J. Membrane Biol, 1997 OCT1 MRP Oatp1 Sécrétion et réabsorption rénales

  6. TRANSPORTEURS HEPATIQUES EN 1997 D. K. MEIJER, Adv. Drug Deliv. Rev., 1997 Métabolisme et excrétion biliaire

  7. Le transport en 2004 ?

  8. Vers l’identification et la cartographie cellulaire des protéines de transport impliquées dans ADME Vers la vectorisation des processus cinétiques de ADME et de nombreuses questions sur leur rôle fonctionnel et leur impact sur les stratégies de développement du médicament

  9. Polyspécificité des substrats transformés ou transportés (CYP 3A –ABCB1 (P-gp)) ENZYMES/TRANSPORTEURS : SIMILITUDES • Protéines • Expression ubiquitaire • Inhibition (domaine des Km, Ki du nM au mM) • Polymorphismes Génétiques • Induction (voies de transcription communes : PXR, CAR, FXR…)

  10. Polymorphisme génétique de la P-gp • Exon 26C 3435 T  mutation silencieuse  C 3435 T 

  11. Polymorphisme génétique de la P-gp : effets sur l’absorption intestinale de la digoxine • CD-TT > CD-CC • AUC TT > AUC CC 38% • En relation avec niveau expression P-gp des entérocytes (barrière intestinale) • TT : faible niveau d’expression • CC : fort niveau d’expression Extrait de Hoffmeyer et al., 2000

  12. Polyspécificité des substrats transportés Cations organiques amphiphatiques ABCB1, ABCC1, ABCG2 Substrats communs entre ABC protéines ABCB1 ABCC1 vbl col dox pra ABCG2 From LITMAN et al. CMLS 2001

  13. Le tandem cinétique enzyme - transporteur Déterminisme ou Stochastisme ? CYPs UGTs T T M-OC M-OC M M M-OH Phase 0 Phase 1 Phase 2 Phase 3 ex : couplage CY3A / P-gp au niveau intestinal régulation coordonnée des gènes ?

  14. ENZYMES/TRANSPORTEURS : DIFFERENCES ATP, GSH, H+, co-facteursde la réaction NADPH, Fe,…

  15. Polarisation de l’expression des transporteurs sur les cellules épithéliales et endothéliales Pôle apical MDR 3 MDR3P-gp MRP1 cMOAT(MRP2) MDR1P-gp Pôle basal Application du concept dans les modèlesin vitro

  16. 2004 –UNE TRENTAINE DE TRANSPORTEURS D’INTERET EN ADME OATs (4) OATPs (9) OCTs (5) ENTs (8) INTESTIN FOIE PROTEINES ABC(7) Pep T 1/2 MCT 1/2 BARRIERES : BHE, placenta, prostate REIN BEAUCOUP D’AUTRES IMPLIQUES EN PK-PDex : bioamines cérébrales (sérotonine, dopamine……)polymorphisme génétique du transporteur 5 HTT

  17. La super famille des protéines ABC 49 transporteurs ATP – Binding Cassette chez l’Homme • Transport actif primaire uniport • théorie « flippase », « vacuum cleaner »(P-gp) • co-transport avec GSH (MRPs)

  18. MRPs : ABCCs NH2 MRP1 extra • MRP1: 190kDa. 930 (MRP9) à 1545 aa (MRP2). • Transporteurs ABC • Dépendent du GSH (co-transport) intra ATP ATP MRP5 extra • Substrats : composés anioniques, conjugués au glutathion, aux sulfates et à l’acide D-glucuronique. Ex: leucotriène C4, oestradiol-17--D-glucuronide. NH2 intra MRP9 ATP ATP Intracellulaire D’après Borst et al.(2000) et Bera et al.(2002) • Inhibiteurs : Probénécide, indométacine, MK571

  19. Signature de la famille N-glyc La super famille des protéines SLC Transporteurs d’anions organiques polypeptides : OATPs/oatps (SLC21A) - superfamille « membrane solute carrier », famille SLC21A/slc21a - transport actif secondaire (GSH, anions inorganiques) - rat /souris / homme : 11/8/9 représentants caractérisés - 643 à 722 aa., 12 TDMs • Substrats : anions organiques de PM >450Da. ex: sels biliaires, DHEA, digoxine, taurocholate, agonistes des récepteurs opioïdes  (DPDPE)… • Inhibiteurs : digoxine, PSC833, probénécide.

  20. La super famille des protéines SLC Transporteurs d’anions organiques : OATs(SLC22A) - Transport actif secondaire - 4 représentants caractérisés (OAT1 à OAT4) - Distribution tissulaire : rein et foie - Cerveau : BHE : OAT3 sur la membrane luminale des cellules endothéliales BHL : OAT1 et OAT3 sur la membrane apicale des cellules épithéliales des PC D’après sweet et al., 2001 - Substrats : acide p-aminohippurique, céphalosporines, AINS, fluorescéine, pesticides, herbicides. - Inhibiteur : probénécide

  21. La super famille des protéines SLC Transporteurs des cations organiques : OCTs (SLC22A) • transport actif secondaire potentiel dépendant : OCT1, OCT2, OCT3, +H dépendant : OCTN1, OCTN2 • distribution : rein et foie intestin, cœur, cerveau, placenta • substrats : amines endogènes (acétylcholine, choline, dopamine, épinéphrine…) cimétidine, morphine, vérapamil, quinine, quinidine, paraquat D’après Koepsell, 1998

  22. Vers le savoir…

  23. TMD0 TMD1 NBD1 TMD2 NBD2 Expression dans des organes pluricellulairesexemple : cerveau et protéines ABC Claire Mercier, Doctorat de l’Université Paris5, 9 décembre 2003 Expression et régulation de quatre transporteurs ABC impliqués dans les mécanismes de multirésistance médicamenteuse, P-gp, Mrp1, Mrp5 et Mxr, chez les rongeurs: le modèle astrocytaire. La MRP1 ou l’ABCC1

  24. Plexus choroïdes Ependyme Ependyme, Astrocytes ss ép. Méninges Glie limitante BHE Ep CP  Cap Mrp1 Cap V M M Ep V V F1 Ep CP Cap GFAP V Expression dans des organes pluricellulairesexemple : cerveau et protéines ABC C. Mercier et al, Brain Res. (soumis) Expression de la Mrp1 sur les barrières cérébrales chez le rat adulte

  25. P-gp Méninges Plexus choroïdes Neurone Ependyme Astrocyte Ventricule Astrocyte BHE Parenchyme cérébral Abcg2 Mrp1 Mrp5 Expression dans des organes pluricellulairesexemple : cerveau et protéines ABC

  26. CELLULE ENDOTHELIALE Membrane basale SANG NEURONE ASTROCYTE JONCTION SERREE Pgp PERICYTE Mrp1 Induction des protéines de transportexemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC

  27. contrôle GPNT 12 h 24 h 48 h 4 h 500 50 500 50 500 0 0 50 500 50 A ARNm mdr1b B GAPDH HL60 + 72 h w contrôle 48 h 48 h 24 h 4 h 12 h PUR et DOX provoquent : transcription du gène mdr1b de manière dose- et temps-dépendante 0 50 500 50 500 50 500 50 500 0 500 P-gp Induction des protéines de transportexemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC Effet de la doxorubicine sur l’expression de mdr1b chez l’astrocyte de ratC. Mercier, J. Neurochem., 2003 Effets de la puromycine sur l’expression de mdr1b dans les cellules endothéliales RBE4P. Demeuse, J. Neurochem., 2004

  28. contrôle PSC833 *** *** ** contrôle 50 ng/mL 500 ng/mL P-gp fonctionnelle et inhibée par PSC833. Corrélation entre l’expression des ARNm, de la protéine et de la fonctionnalité. Régulation de l’expression de la P-gp dans les astrocytes de rat C. Mercier, J. Neurochem., 2003 Activité fonctionnelle, 24 h d’exposition à la vincristine

  29. cavéoline Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G Fanchon Bourasset, Doctorat de l’Université Paris5, 17 décembre 2003 Implication des transporteurs d’influx et d’efflux dans la neuropharmacocinétique des xénobiotiques La P-gp ou l’ABCB1

  30. Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G Problématique : pourquoi l’activité analgésique du morphine-6 glucuronide (M6G) est supérieure à celle de la morphine alors que sa perméabilité membranaire est dix fois plus faible ? • Données bibliographiques : • Inhibition du passage de la BHE par le PSC 833 et le vérapamil (BBB in vitro, Huwyler, 96, 98; in vivo, Lötsch, 02) • Effet analgésique identique entre mdr 1a (-/-) et mdr 1a (+/+) pour le M6G (Lötsch, 00) mais différent pour la morphine (Thompson, 00)

  31. Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G Hypothèses testées par la méthode de perfusion cérébrale in situ • Rôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6G : • souris sauvages / déficientes en P-gp (mdr1a (-/-)), +/- digoxine, PSC833 • Rôle de transporteurs d’anions organiques • - Mrp1 (souris sauvages / mrp1 (-/-)) • - oatps, souris sauvages +/- digoxine, PSC833 • Rôle de GLUT-1

  32. Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G Kin expérimental Kin prédit 1000 imipramine S18986 100 diazépam 10 1 D-glc TXD258 morphine vinblastine 0,1 M6G Kin(µl/g/s) vincristine 0,01 0,001 sucrose 0,0001 0,00001 0,000001 0,0001 0,01 1 100 10000 1/2 P/MM

  33. Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G ANIONS ORGANIQUES NUTRIMENTS CATIONS ORGANIQUES GLUT 1LAT 1 P-gp OATP Aoatp 2 MCT1 membraneluminale ATP ? membrane abluminale Na+ A, B0+ ASC OCT? OAT SANG CERVEAU

  34. Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G F. Bourasset et al, J. Neurochem, 2003 • P-gp non impliquée • Mrp1 non impliquée Transport du M6G à travers la BHE par: • GLUT-1 • Transporteur sensible à la digoxine et PSC833: oatp2?

  35. OATP Aoatp 2 GLUT 1 ATP Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G SANG P-gp membraneluminale X membrane abluminale CERVEAU

  36. OATP Aoatp 2 ATP Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par la digoxine et les enképhalines (DPDPE) PSC 833 SANG P-gp membraneluminale membrane abluminale CERVEAU

  37. NBD TMD Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) Etudes fonctionnelles de protéines ABC ( P-glycoprotéine, Mrp1, Bcrp) au niveau de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs Salvatore Cisternino, Doctorat de l’Université Paris5, 19 décembre 2003 La MXR ou l’ABCG2 OUT IN GMP 2004

  38. Off 2 La perfusion cérébrale in situ Saccharose* + molécule étudiée * Tampon physiologique • Isole le cerveau /organisme • Parfait contrôle du milieu de perfusion • Sensible • Simple • Possibilité de vérification de l’intégrité de la BHE • Applications: • Rat (Takasato et coll., 1984) • Souris (Dagenais et coll., 2000) 1 On GMP 2004

  39. mrp1(+/+) mrp1(-/-) Mesure du transport cérébral en trans-influx zéro :Souris Mrp1(-/-) vs. Souris sauvages (S. Cisternino et al, Pharm. Res., 2003) Pas d’effet de la Mrp1 sur le transport cérébral de ces molécules (idem 99mTc-Sestamibi; Cattelotte et coll.,2004) GMP 2004

  40. Influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral au niveau de la BHE chez la souris ABCG2 (MRP 1) (BCRP) ? ATP ATP ATP Eisenblatter et coll., 2002; 2003 Cooray et coll., 2002Zhang et coll., 2003 ESPACE VASCULAIRE ABCB1 ABCC1 (P-gp) Membraneluminale X Membrane abluminale PARENCHYME CEREBRAL

  41. Étude menée in vivo pour déterminer l’influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral La BCRP (ABCG2 ou MXR) Structure: 72 Kda (monomère) protéine ABC sous famille G 6 segments, 1 TMD, 1 NBD Homodimérisation Phénotype MDR Substrats: Mitoxantrone, prazosine, SN38, 3TC Modulateurs: GF120918, Fumitrémorgine C Localisation: Physiologique et tumorale rein, intestin, placenta, BHE Subcellulaire: Apicale co-localisation avec la P-gp (polarisé) BHE In vitro : cellules endothéliales de porc, homme In vivo : pas de données

  42. Methodologie : Perfusion cérébrale in situ chez la souris Mesure du transport cérébral: Substrat mixte P-gp/Bcrp: [3H]-Mitoxantrone (MX) [3H]-Prazosine Non substrat de la Bcrp: [3H]-Vinblastine Souris : Sauvage & Mdr1a(-/-)Composés : [3H]Mitoxantrone [3H]Prazosine[3H]Vinblastine [14C]Sucrose GF120918 PSC833 • Influence de la P-gp : • comparaison sauvage / Mdr1a(-/-) • -PSC833 (modulateur de la P-gp) • Influence de la Bcrp : • - GF120918 (modulateur mixte Bcrp/P-gp)

  43. Méthodologie : Etude de biologie moléculaire • Déplétion Capillaire (Triguero et coll., 1990): • Perfusion cérébrale in situ avec un tampon (rincer le cerveau du sang) • Déplétion – homogénéisation mécanique–centrifugation • Culot (capillaires cérébraux) souris sauvage / mdr1a(-/-) RT-PCR quantitative en temps réel (cortex; capillaire cérébral) : abcg2 ARNm gapdh ARNm (référence) Spécificité (gel d’agarose, courbe de dissociation)

  44. 4 †† souris sauvage ) *** -1 g souris mdr1a(-/-) 3 -1 *** (µl s in 2 ** H]-Prazosine K 1 3 [ 0 PSC833 GF120918 Prazosine (3 µM) (2 µM) (30 µM) Étude du transport cérébral de la [3H]-prazosine chez la souris Témoins Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de prazosine Efflux indépendant de la P-gp (GF120918, prazosine), surexpression ?

  45. †† 6 ) *** -1 Souris sauvage g 5 -1 Souris mdr1a(-/-) (µl s 4 *** in 3 †† ]-Mitoxantrone K 2 1 3 [H 0 PSC833 GF120918 (3 µM) (2 µM) Étude du transport cérébral de la [3H]-mitoxantrone chez la souris Témoins MX 100 µM Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de MX Efflux indépendant de la P-gp (GF120918), surexpression ?

  46. Transcrits d’abcg2 dans le cortex et les capillaires du cerveau de souris par Q-RT-PCR abcg2 ARNm gapdh sauvage mdr1a ( - / - ) Cortex cérébral 1.0 0.2 ND ± Fractions de Capillaires cérébraux ± 2200 200 680 ± 50 Enrichissement d’abcg2 au niveau des capillaires cérébraux Compensation de mdr1a par l’abcg2

  47. Conclusions • GF120918 inhibe un transporteur d’efflux autre que la P-gp et impliqué dans le transport de la MX et de la PRA 2) Inhibition par le GF120918 est plus forte pour les souris mdr1a(-/-) que pour les souris sauvages pour le transport de MX et de PRA 3) Ce transport n’est pas sensible au PSC833 (pas d’effet sur la Bcrp) 4) RT-PCR confirme la présence et l’enrichissement des transcrits d’ abcg2 au niveau du capillaire cérébral 5) Abcg2 est surexprimée au niveau des capillaires de souris mutantes mdr1a(-/-)

  48. Synergie entre ABC protéineset physiopathologies B 3(MDR 3) Canalicule biliaire Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis (PFIC type 3) Phospholipids PMG and MDR Micelles Drugs B 1 B 11( BSEP) Bile salts (MDR 1, PGP) Bilirubine Conjugates and Drugs PFIC Type2 Cholesterol G5/G8 (MRP 2) C2 DUBIN-JOHNSON SYNDROME SITOSTEROLEMIA

  49. Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) Quel modèle d’étude du transport ? A quel stade du développement ? Quelle réponse? a) Possibilité de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax, KT…)

  50. Pharmacocinétique des systèmes intégrés et physiopathologiques Vers le futur … Synergie entre modèles vitro-vivo Pharmacocinétiquemoléculaire et cellulaire

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