1 / 29

ODBORNÁ PRAXE

ODBORNÁ PRAXE. Zuzana KAUEROVÁ 4. r. biochemie 2004/2005. A) ÚVOD. 1. POPIS LABORATOŘÍ Soukromé imunoanalytické a mikrobiologické laboratoře RNDr. Čecháček s. r. o. , Bratislavská 2, 604 70 Brno Oddělení: mikrobiologické, sérologické a imunoanalytické laboratoře.

benny
Download Presentation

ODBORNÁ PRAXE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ODBORNÁPRAXE Zuzana KAUEROVÁ 4. r. biochemie 2004/2005

  2. A) ÚVOD 1. POPIS LABORATOŘÍ • Soukromé imunoanalytické a mikrobiologické laboratoře RNDr. Čecháček s. r. o. , Bratislavská 2, 604 70 Brno • Oddělení: mikrobiologické, sérologické a imunoanalytické laboratoře

  3. Sérologie a imunoanalýza Imunokomplexní reakce – ELISA, EIA, RIA, KFR, aglutinace, hemaglutinace, precipitace, Western Blott PCR s elektroforetickou detekcí Detektory fotometrické, fluorimetrické, luminometrické, radioaktivní Mikrobiologie Gynekologické materiály, hemokultury, moč, stolice, punktát, rány, sputum, výtěry, vyšetření sterility, mykologie. 2. ČINNOST LABORATOŘÍ

  4. B) SÉROLOGIE • STANOVENÍ ANTI – HAV (IgM) V LIDSKÉM SÉRU METODOU ELISA • kvalitativní detekce protilátek (Ab) IgM in vitro proti viru hepatitidy A, indikace akutní infekce od staré • ELISA – enzymová imunoanalýza, princip dvojitého sendviče (firma Murex), detekce fotometricky

  5. 1.1 POSTUP PŘI PRÁCI • 100x naředění vzorku (1 ml konjugátu + 10 μl vzorku) • Pipetáž do stripu po 100 μl

  6. Inkubace 60 minut při teplotě 37 °C • Promytí jamek 5x na automatické promývačce • Přidat po 100 μl konjugátu, 60 minut inkubace • Přidat stejné množství substrátového roztoku, inkubace 30 minut => barevná změna na modrozelenou • Zastavení reakce 1M kyselinou sírovou, proměření ve spektrofotometru

  7. 1.2 VÝSLEDKY • řazeno dle pořadí ve stripu, poslední tři hodnoty bez vzorku • naměřené absorbance:

  8. 1.3 VYHODNOCENÍ • Výpočet hodnot absorbance negativních kontrol: A = (0,092 + 0,104) : 2 = 0,098 •CUT OFF rovno součtu průměru absorbance neg. Kontrol a hodnoty 0,2: X = 0,2 + 0,098 = 0,298

  9. •hodnoty naměřené u pacienta:0,087 ; 0,102; • Naměřené hodnoty pacienta jsou srovnatelné s negativními kontrolami –VZOREK Č. 79910 BYL NEGATIVNÍ •diagnostická senzitivita Murex anti – HAV (IgM) testu se odhaduje na 98,8 % s intervalem spolehlivosti 96,4 – 99,68 %.

  10. 2. STANOVENÍ DNA CYTOMEGALOVIRU (CMV) in vitro V MOČI NEBO SÉRU • Indikace onemocnění způsobeného napadením organizmu CMV (herpetické viry) • Stanovení především u těhotných (poškození plodu) • Metoda PCR – Polymere Chain Reaction – enzymatická syntéza sekvencí DNA za využití syntetických oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární s hledanou cílovou sekvencí na obou vláknech DNA • Identifikace DNA gelovou elektroforézou

  11. 2.1 POSTUP PŘI PRÁCI a) Separace soupravou Chemagen Biopolymer – Technologie CMV (Elisabeth Farmacon s. r. o.) extrakcí na magnetických partikulích • Lýza buněk, denaturace nepotřebných bílkovin enzymem proteázou • Navázání DNA na magnetické partikule, odstranění denaturovaných bílkovin a vazba DNA na eluční pufr (principem změna pH a tím i afinity) => uvolnění DNA

  12. b) Vlastní PCR • Aplikace specifického primeru v tzv. amplifikaci – dvoufázový cyklus teplot 94 °- 60 °- 72 °C v thermocykleru: • 94 °C – denaturace (rozdvojení) vlákna DNA • 60 °C – zmnožení sekvencí DNA aktivací primeru • 72 °C – aktivace termostabilní DNA – polymerázy, která doplní komplementární dvojice dvoušroubovice

  13. c) Imunoelektroforéza • Nalití agarózového gelu s malým množstvím barevného indikátoru (ethidiumbromid, viditelný pod UV – zářením, koncentrace 2,5 μl/50 ml), po zchladnutí vytvořit zářezy. • Umístění markerů do zářezů, dále vzorky a pozitivní a negativní kontroly. Spustí se zdroj napětí => elektroendoosmóza, difúze vzorků. • Po 45 minutách vyhodnocení.

  14. 2.2 VYHODNOCENÍ

  15. Poloha vzorků na elektroforeogramu se ve všech případech blíží negativním kontrolám, všechny vzorky jsou NEGATIVNÍ

  16. C) MIKROBIOLOGIE • ANALÝZA VÝTĚRU Z KRKU •Odběr při podezření na infekční onemocnění horních cest dýchacích – tonzilitidách a akutních zánětech hrtanu • akutní tonzilitidy – rhinoviry, koronaviry, adenoviry, EB – viry, coxsackviry • akutní záněty hltanu – Streptococcus pyogenes, Str. pneumoniae, Haemophillus influenzae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitis

  17. 1.1 MATERIÁL • Výtěr z krku pacienta (6 – ti leté dítě, podezření na akutní tonzilitidu) • Půdy: • Krevní agar (KA) • Endův agar (EA) • NaCl – agar (NaCl) • Miller – Hüntenova půda (MHA)

  18. 1.2 ZPRACOVÁNÍ • Vyočkování tamponu se vzorkem na KA, EA a NaCl (křížová metoda) • Inkubace 24 hodin při teplotě 37 ° • Analýza primokultury: => šedobílé drobné kolonie, satelitní růst – podezření na rod Haemophillus • bělavé mukózní kolonie, β – hemolýza (neúplná) – podezření na rod Staphylococcus • Nažloutlé kolonie s hemolýzou α – podezření na rod Streptococcus

  19. •znovu pomnožit na KA s druhem Staphylococcus aureus, vložit disky se streptomycinem (S) a bacitracinem (BAC), inkubace 24 h při 37 °C •Analýza pomnožené kultury: • Stafylokok neurčeného druhu silná β – hemolýza , kolem BAC zóna inhibice • Kolem zlatého stafylokoku růst velkého množství rodu Haemophillus, malé, tužší bílé kolonie • Streptokok α hemolýza, zóna inhibice kolem disku s S

  20. 1.3 VYHODNOCENÍ • Identifikace druhu Streptococcus • testy na polysacharidovou substanci C pomocí latexové aglutinace • pozitivní reakce nastala u typu A => druh Streptococcus pyogenes

  21. b) Identifikace druhu Staphylococcus • test na katalázu a latexová aglutinace k průkazu plazmakoagulázy • test na katalázu silně pozitivní, plazmakoaguláza pozitivní => druh Staphylococcus aureus

  22. c) Identifikace druhu Haemophillus • Naočkování kolonie na MHA, vložit disky s faktory V, X a VX; inkubace 24 h při 37 °C • Po inkubaci na agaru růst kolonií kolem faktoru VX a X => druh Haemophillus influenzae Z testů plyne, že pacient je nakažen těmito mikroorganizmy: Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haemophillus influenazae Doporučuje se antibiotiková léčba.

  23. 2. ANALÝZA GYNEKOLOGICKÉHO POŠEVNÍHO VÝTĚRU •nejčastěji výtěry z pochvy, cervix, plodová voda, sperma, gynekologické rány, stěry z glans penis, mateřské mléko apod. • vyšetření při podezření na zánětlivá onemocnění pochvy, způsobená kvasinkami, gardnerelami, mykoplazmaty atd.

  24. 2.1 MATERIÁLY • Gynekologický materiál – v tomto případě výtěr z pochvy • Půdy: • Krevní agar (KA) • Krevní agar s amikacinem (KA – A) • Krevní agar s vysokým procentem soli (NaCl) • Endův agar (EA) • Selektivní půda pro rod Gardnerella (GAR) • Dvě půdy na mykoplazmata

  25. 2.2 ZPRACOVÁNÍ • Nátěr, tzv. „MOP“, barvený dle Gramma a Giemsy V obou preparátech pouze rod Lactobacillus – přirozená mikroflóra - geometrické tvary, tzv. „döderleiny“

  26. •Analýza kolonií na půdách: • KA – A: drobné bílé kolonie s rozsáhlou hemolýzou – rod Lactobacillus • EA: žádné kolonie (nepřítomnost enterokoků) • NaCl: žádné kolonie (nepřítomnost Streptococcus agalactiae) • GAR: žádné kolonie • Test na mykoplazmata: ani po 48 hodinách žádná barevná změna - negativní

  27. 2.3 VYHODNOCENÍ • VÝTĚR FYZIOLOGICKÝ, BEZ ZNÁMEK PATOGENITY.

More Related