Scopi della analisi molecolare

1. Scopi della analisi molecolare • Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti • Ricerca dei portatori sani • Diagnosi prenatale

2. Patologia Genetica • Patologia Monogenica: • malattie dovute a mutazioni di un singolo gene • Patologia Poligenica: • malattie dovute a mutazioni di più geni, generalmente con presenza di una componente ambientale • Patologia Cromosomica: • malattie dovute ad alterazioni numeriche o strutturali del cariotipo

3. Il cariotipo: una sola analisi per diverse patologie

4. Analisi molecolare: una analisi specifica per una specifica patologia

5. Tutto inizia dal DNA • Molecola depositaria del patrimonio genetico • Trasporta l' informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari http://learn.genetics.utah.edu/

6. Campioni da cui si può estrarre DNA • Una goccia di sangue • Saliva presente su una sigaretta o su un chewing-gum • Tracce di sperma • Urine e feci • Un capello • Fossili • Mummie

7. Estrazione di DNA • Varie metodiche per estrazione DNA • Estrazione manuale: vari kit in commercio ( spin basket, biglie magnetiche) • Estrattori automatici

8. Estrazione Dna da sangue mediante Kit commerciali • Campione di sangue in EDTA • Aliquotare 200μl di Binding Buffer • Aggiungere 40 μl di proteinasi K • Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco • Spinnare • Aggiungere 100μl di isopropanolo • Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa • Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare per 1 min • Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer • Aggiungere 200μl di Elution Buffer • Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA

9. Reazione a catena della polimerasi (PCR) • Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA • Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

10. PCR: 3 Fasi • Denaturazione : apertura doppia elica • Annealing : attacco dei primers • Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi

11. Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)

12. Reagenti necessari per la PCR • DNA • Primers • Oligonucleotidi • Taq polimerasi • Baffer e Magnesio • H2O Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo 35 cicli 72°C 10 m 1 ciclo 94°C 30s 58°C 30s 72°C 30s

13. Preparazione di una PCR http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

14. Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici • Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato • Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCR

15. Elettroforesi su gel • Si preparano i gel di agarosio che costituiscono una “matrice a setaccio” • Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico • La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo • La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico • Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)

16. Sequenziamento diretto del DNA • Metodo accurato per ottenere informazioni precise e definitive su un gene • Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi

17. Sequenza di DNA

18. Mutazione in eterozigosi

19. MUTAZIONE IN OMOZIGOSI

20. Analisi di frammenti • Riconoscimento di paternità • Identificazione di autori di reati • Identificazione di vittime di reati o sinistri