ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

1. ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA “Establecimiento, inducción y evaluación a callogénesis in vitro de meristemos apicales de árboles jóvenes de Romerillo (Podocarpus oleifolius) como futura estrategia de conservación de la especie en el Distrito Metropolitano de Quito”. Previo a la obtención del título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA Elaborado por: JUAN CARLOS JÁCOME QUINTANILLA Directora: Ing. Tatiana Páez Codirector: Mat. Pedro Romero

2. INTRODUCCIÓN Problema Tasa de deforestación Estabilidad ambiental Podocarpus oleifolius Catalogada como conífera en riesgo menor Preocupación por una acelerada eliminación Bosques selectivamente extraídos Impacto ecológico y económico Disminución de la diversidad Multiplicar masivamente Fuente renovable y sustentable Justificación Embriogénesis somática indirecta Callogénesis No existen investigaciones

3. OBJETIVOS Desarrollar un método para el establecimiento y la inducción a callo embriogénico in vitro a partir de meristemos apicales de árboles jóvenes de Podocarpus oleifolius como una estrategia de conservación de la especie en el Distrito Metropolitano de Quito. General Implementar un procedimiento de desinfección adecuado. Evaluar la mejor formulación nutritiva para el establecimiento e inducción a callogénesis. Determinar el efecto de diferentes combinaciones y dosis de fitohormonas y reguladores de crecimiento en la inducción a callogénesis. Identificar morfológica e histológicamente los callos obtenidos en la etapa de inducción. Evaluar el efecto en la proliferación de callos embriogénicos en condiciones de luz y oscuridad. Específicos

4. HIPÓTESIS La variación del medio de cultivo y las diferentes dosis de reguladores de crecimiento induce de manera directa la formación y proliferación de callo embriogénico in vitro de meristemos apicales de árboles juveniles de Podocarpus oleifolius.

5. INTRODUCCIÓN Forestal Romerillo Podocarpusoleifolius Conífera autóctona del Ecuador Árboles de hasta 45 m de altura 1500 – 3000 m.s.n.m Bosques húmedos Siempre verde, con fuste recto Apreciado por su madera Mueblería fina, tallados, puertas, etc. Planes de reforestación

6. INTRODUCCIÓN A nivel sudamericano Costa Rica, El Salvador, Panamá, Honduras, México Distribución geográfica A nivel nacional Cañar, Cotopaxi, Azuay, Loja En el Distrito Metropolitano de Quito Estribaciones del Volcán Guagua Pichincha Lloa, Bosque Tandacato Nono, Nanegal, Nanegalito San José de Minas, Calacalí y Gualea

7. INTRODUCCIÓN Descripción botánica Árbol dioco Hojas lanceoladas Hojas – Punta espinosa Conos masculinos laterales Conos femeninos en pedúnculos axilares Sexual Sexual Semillas – trat. pre-germinativo Aspectos Reproductivos Aspectos reproductivos Asexual Estacas o acodos de raíz y ramas

8. INTRODUCCIÓN Proceso de callogénesis Proceso de Embriogénesis Somática Indirecta

9. Materiales y métodos Fase de campo Vivero la Armenia - Conocoto Selección y colecta del material vegetal Laboratorio de Micropropagación EPMMOP Fase de laboratorio Yemas apicales Desinfección y establecimiento Inducción a callo embriogénico Proliferación de callo embriogénico Identificación del callo embriogénico

10. Materiales y métodos Desinfección y establecimiento Aplicación de tratamientos de desinfección Lavado con detergente Yemas apicales Variable: sobrevivencia Disección de brácteas Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 16/8horas luz/ oscuridad Siembra meristemo Extracción del meristemo

11. Materiales y métodos Inducción a callo embriogénico – primer ensayo Inducción a callo embriogénico – segundo ensayo Desinfección Extracción del meristemo Análisis Macro-morfológico Identificación del callo embriogénico • Variables evaluadas: • Mejor tratamiento • Tiempo de inducción Evaluación: 30, 40, 50 y 60 días • Friabilidad • Color Incubación de meristemos en oscuridad Siembra Meristemo 2da Inducción

12. Materiales y métodos Identificación del callo embriogénico 1 Análisis Macro-morfológico Análisis Histológico 2 • A partir de porciones de callo - 0.5 mm • Tinción con acetocarmín al 2% - 15 “ • Lavado con agua destilada • Observación al microscopio óptico 100 x • Friabilidad • Color

13. Materiales y métodos Proliferación Dividir en tres partes iguales el callo y pesarlos en la balanza electrónica analítica. Callos embriogénicos Sembrar tres porciones de callo • Variables evaluadas: • Diferencia del peso de las porciones de callo luego de 30 días.

14. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 1: Datos de frecuencia y porcentaje de las variables: mortalidad y sobrevivencia de los meristemos apicales de romerillo, obtenidos en la fase de desinfección después de 21 días. Desinfección y establecimiento Figura 1: Porcentajes de las variables: sobrevivencia y mortalidad, evaluadas en la etapa de desinfección después de 21 días.

15. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 2:Frecuencias y porcentajes de los diferentes agentes causales responsables del descarte de los meristemos apicales de romerillo durante la fase de desinfección después de 21 días. Desinfección y establecimiento Hongo Bacteria Necrosis

16. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 2: Porcentajes de los diferentes agentes causales responsables del descarte de los meristemos apicales de romerillo después de 21 días. Desinfección y establecimiento

17. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3: Análisis de varianza para los diferentes tratamientos de desinfección. Desinfección y establecimiento F calculado (9.033) >F crítica (3.101)

18. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 4: Frecuencias y porcentajes de los meristemos establecidos a los 21 días después de ser aplicados los tratamientos de desinfección. Desinfección y establecimiento Figura 3: Porcentaje de los meristemos establecidos y no establecidos en la etapa de desinfección después de 21 días.

19. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 5: Frecuencias y porcentajes de formación de callo a partir de meristemos apicales de romerillo durante la fase de inducción – primer ensayo, después de 60 días. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo Tabla 6:Frecuencias de la formación de callo a partir de meristemos durante la fase de inducción – primer ensayo, evaluados a los 30, 40, 50 y 60 días.

20. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 4: Número de callos formados en los diferentes tratamientos de inducción evaluados a los 60 días. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo Figura 5: Número de callos formados a los 30, 40, 50 y 60 días en los diferentes tratamientos de inducción.

21. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 7: Identificación de callos embriogénicos presentes en el tercer tratamiento del primer ensayo de inducción. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo 30 días 40 días 50 días 60 días “X”: Cumple con las características de los callos embriogénicos.

22. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 8: Porcentajes de callos embriogénicos formados en el tercer tratamiento, del primer ensayo de inducción. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo

23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 9: Análisis de varianza para las variables: formación de callos y tiempo – primer ensayo. Inducción de callo embriogénico – primer ensayo F calculado (2.00) <F crítica (2.25) Tratamientos: F calculado (2.95) <F crítica (2.96) Días:

24. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 10: Frecuencias y porcentajes de formación de callo embriogénico a partir de meristemos apicales de romerillo durante la fase de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 60 días.. . Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo Tabla 11: Frecuencias y porcentajes de la formación de callo embriogénico a partir de meristemos apicales de romerillo, durante la fase de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 50 y 60 días.

25. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 6: Número de callos embriogénicos formados en los diferentes tratamientos de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 60 días. Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo Figura 7: Número de callos embriogénicos formados en los diferentes tratamientos de inducción – segundo ensayo, evaluados a los 50 y 60 días. Tratamiento 1: MS (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP) + 30gsacarosa + mioinositol Tratamiento 4: MS (3 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L BAP) + 45gsacarosa + mioinositol

26. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 12: Análisis de varianza para las variables: formación de callos y tiempo – segundo ensayo. Inducción de callo embriogénico – segundo ensayo F calculado (2.92) <F crítica (3.78) Tratamientos: F calculado (12.39) >F crítica (5.59) Días:

27. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis morfológico – primer ensayo Callo compacto de color blanco tomado del primer tratamiento, el cual no presenta características morfológicas de un callo embriogénico. Meristemo de romerillo tomado del octavo tratamiento que no formó callo. Callo translúcido, friable de color amarillo-verde, tomado del tercer tratamiento que dio los mejores resultados en la formación de callo embriogénico.

28. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis morfológico e histológico – segundo ensayo Observación al estereoscopio del callo embriogénico. Callo translúcido, friable tomado del cuarto tratamiento • Tinción con acetocarmín 2% (p/v) • Agregados de células redondas • Citoplasma denso • Núcleo grande 100x

29. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 13: Resultados de callos embriogénicos sometidos a proliferación en diferentes estados de incubación, evaluados después de 30 días. Proliferación de callo embriogénico

30. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 14: Prueba inferencial – intervalo de confianza de los pesos obtenidos en la proliferación de callo embriogénico, en estado de oscuridad. Proliferación de callo embriogénico Figura 9: Proliferación de callos embriogénicos después de 30 días de evaluados. A. Zona del callo de color verde aún viable. B. Zona del callo embriogénico en proceso de necrosis. Figura 8: Callos necrosados después de 30 días de evaluados en la etapa de proliferación.

31. CONCLUSIONES

32. RECOMENDACIONES

33. GRACIAS