DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

1. DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA  INDUCCIÓN AL PROCESO DE CALLOGÉNESIS in vitro A PARTIR DE COTILEDONES Y EJES EMBRIOGÉNICOS DE SEMILLAS DE GUARANGO (Caesalpiniaspinosa) COMO COADYUVANTE PARA SU PRESERVACIÓN EN EL DISTRITO METROPOLITANO DE QUITO Previo a la obtención del título de: Ingeniera EN BIOTECNOLOGÍA Elaborado por: GABRIELA MARÍA ORTEGA ORDÓÑEZ Director: Ing. Norman Soria Codirector: Ing. Marco Taipe

2. JUSTIFICACIÓN PROBLEMA Deforestación Mundial La necesidad de grandes cantidades de ejemplares de especies nativas forestales - proyectos de Forestación y Reforestación MDMQ El año 2001, DMQ existía aprox. 9.000ha de bosques naturales y plantaciones forestales. CIAC => promueve biotecnologías agronómicas Amortiguar impactos ambientales: CALLOGENESIS en Caesalpiniaspinosa Necesidad de 18.000ha de cubierta forestal • Especie nativa forestal • En peligro en extinción • Protección a suelos erosionados • Potencial industrial Limitación de los viveros en la multiplicación de forestales • Prácticas tradicionales de cultivo • Obtención rápida y masiva de ejemplares • Mejoramiento de árboles forestales • Gran cantidad de mano de obra • Requerimiento de amplio espacio

3. OBJETIVOS General

4. INTRODUCCIÓN Guarango (Caesalpinia spinosa) (Molina) O. Kuntze • Descripción botánica Distribución geográfica • 4 a 8 metros de altura • Árbol nativo de los Andes, 1500 a 3100 msnm • Ramas contienen espinas • Ecuador: Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Azuay y Loja • Hojas son compuestas, bipinadas, alternas en espiral • Frutos son legumbres aplanadas y curvas, que cambian de color, según su madurez de verde a rosado y finalmente rojo parduzco; de 5 a 10 cm de largo. • Mancha blanca (Oidium) • Enfermedades • Queresas y áfidos en hojas y en frutos

5. INTRODUCCIÓN • Características de semillas de guarango • Capacidad germinativa que oscila entre 80 y 90%. • Germinación epigea, inicia entre los 8 a 12 días y finaliza a los 20 días. • Requiere un método de escarificación como tratamiento pre-germinativo. • Consta de un embrión • Eje embriogénico o embrionario • Endospermo • Cubierta seminal • Dicotiledónea Excelente adaptabilidad Protección y recuperación de suelos por proceso de erosión – Fijación N2 • Propiedades del guarango Potencial productivo de taninos En asociación con cultivos mejora capacidad productiva

6. INTRODUCCIÓN Vías de generación masiva in vitro de plantas mediante inducción a callo Tipos de explantes Establecimiento in vitro Planta madre No viable Proceso de Callogénesis

7. MATERIALES Y MÉTODOS Desinfección química Carboxin – Captan Semillas maduras de plantas adultas de Caesalpiniaspinosa Desinfección y establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones Banco de semillas del vivero de Cununyacu de la EPMMOP-Q (-5°C) Ensayo Preliminar de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones Ensayo Final de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones Identificación del callo embriogénico

8. MATERIALES Y MÉTODOS Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones LAVADO - DETERGENTE 40 min agitación Solución 1:100 Detergente Triple enjuague Semillas en agua destilada por 2días Escarificación con cautín en la zona del micrópilo

9. MATERIALES Y MÉTODOS Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones Preparación medio MS Siembra de los explantes Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad Retirar la testa de la semillas y separar los cotiledones de los ejes

10. MATERIALES Y MÉTODOS Ensayo Preliminar de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones Desinfección Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad Siembra de los explantes

11. MATERIALES Y MÉTODOS Ensayo Final de Inducción a callo embriogénico a partir de Cotiledones Desinfección Extracción y Siembra de: cotiledones Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

12. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones Explantes Vivos en Cotiledones y Ejes Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos. Porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos

13. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis COTILEDONES Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte .

14. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis EJES EMBRIONARIOS Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte .

15. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico FI Formación de callo a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días.

16. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Tiempo de formación de callo a partir de Cotiledones Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo

17. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Morfología de callos formados a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en cotiledones. Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los cotiledones, por combinación de conglomerados re-escalados.

18. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días

19. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Formación de callo a partir de Ejes embrionarios Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días.

20. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Tiempo de formación de callo a partir de Ejes Porcentajes de callo formados en ejes embriogénicos a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo.

21. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Morfología de callos formados a partir de Ejes Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en ejes embriogénicos. Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los ejes embriogénicos, por combinación de conglomerados re-escalados .

22. Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Ejes E. Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en ejes e., evaluados a los 60 días

23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Formación de callo Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones PI Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación, ausencia de callo y callos descartados en cotiledones, evaluados a los 60 días.

24. Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones Tiempo de formación de callo 2,4D + Kin TDZ + AIA Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo

25. Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones Morfología de los callo Según la textura y el color expresado en el callo formado se identifica el tipo de callo es decir si es embriogénico o no ya que depende del tratamiento. Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes del color y textura de los callo formados en cotiledones.

26. Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos, no embriogénicos y ausencia de formación de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días

27. CONCLUSIONES

28. CONCLUSIONES

29. RECOMENDACIONES • Para disminuir el porcentaje de necrosis en la desinfección de cotiledones y ejes embriogénicos se deberá probar nuevos procesos de desinfección basado en la utilización de peróxido de hidrógeno (H2O2) puesto que ha presentado buenos resultados en la desinfección de semillas de otras especies. • Es importante realizar otro tipo de estudios histológicos con la finalidad de identificar estructuras adicionales a las ya señaladas para tener un mayor conocimiento referente a los procesos de la callogénesis in vitro en cotiledones de Caesalpiniaspinosa que permita ampliar su entendimiento. • Continuar la investigación, tendiente a lograr un protocolo eficiente de embriogénesis somática indirecta en cotiledones y ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpiniaspinosa. • Con base en los resultados obtenidos, se podría probar nuevas combinaciones y concentraciones adicionales de auxinas y citoquininas para la obtención de callos embriogénicos en ejes embriogénicos. • Ya que se generaron posibles vías de organogénesis en los ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpiniaspinosa, se puede continuar el estudio ésta ruta in vitro de generación masiva de plantas.