EUPHRESCO 2008-2009

1. EUPHRESCO 2008-2009 Státní rostlinolékařská správa Odbor diagnostiky

2. Zapojení SRS do projektů Euphresco1/ Cystotvorná háďátka bramborová r. Globodera – testy odborné způsobilosti diagnostiky druhů a ověření metodiky testování rezistence (DL Praha) 2/ Ověření diagnostických metod detekce a identifikace molicemi přenášených virů regulovaných či karanténních v rámci EU (DL Olomouc)

3. Část 1 – Globodera (DL Praha)Řešitelé: Vladimír Gaar, Ludmila Neubauerová Cíle projektu: 1/ ověřit úroveň zúčastněných laboratoří při identifikaci cystotvorných háďátek r. Globodera 2/ pomocí vlastní zvolené metody ověřit účinnost testování rezistence odrůd brambor

4. Účastníci projektu:Belgie, Bulharsko, Česká republika, Francie, Irsko, Itálie, Maďarsko, Německo, Nizozemsko, Rakousko, Řecko, Slovinsko, Španělsko, Turecko, Velká Británie Garanti projektu: Loes den Nijs (NL), Nicole Viaene (B)

5. Plánovaný průběh projektu - X.08 – pilotní schůzka účastníků (Gent) - XI.-XII.08 – 1. část testů: testy identifikace • III.09 – 2. část: biologické testy - stanovení rezistence dodaných odrůd (Pf:Pi) - léto 09 – sklizeň a vyhodnocení testů - X.09 – závěrečná schůzka (Gent)

6. Skutečný průběh projektu:20081/ jednání a koordinace projektu s MZe2/ přiděleny finanční prostředky (65.000 Kč) – cestovné, spotřební materiál3/ účast na pilotní schůzce4/ provedena první část testů (diagnostika 8 vzorků -neznámých cyst r. Globodera: morfologicky, PCR)

7. Perinea Globodera pallida a G. rostochiensis

8. 20091/ přiděleny finanční prostředky (67.000 Kč)2/ II. došly z NL vzorky cyst + hlíz, III.09 bude založen biologický test rezistence, po jeho vyhodnocení zpracována a odeslána závěrečná zpráva3/ závěrečná schůzka (zhodnocení projektu, porovnání účinnosti jednotlivých národních postupů s metodou závaznou pro ČS EU (Council Directive 20007/33/EC), doporučení změn(?)

9. Část 2 – (DL Olomouc)Řešitelky: Gabriela Červená, Hana OrságováOvěření diagnostických metod detekce a identifikace molicemi přenášených virů regulovaných či karanténních v rámci EU

10. Zadání projektu:Pomocí standardní PCR (popř. real-time PCR) ověřit diagnostické metody detekce a identifikace molicemi přenášených virů regulovaných či karanténních, týkajících se území Evropy.Ověřované metody budou porovnány se stávajícími standardy používanými ve většině laboratoří a získaná validační data budou použita při tvorbě nových EPPO protokolů.Pozn.:Laboratoř DL Olomouc se účastní projektu pouze metodou klasické PCR

11. Zaměření projektu: a. Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV, Genus Crinivirusb.  Cucumber vein yellowing virus, CVYV, Genus Ipomovirus c.  Tomato chlorosis virus, ToCV, Genus Crinivirusd.  Tomato infectious chlorosis virus, TICV, Genus Criniviruse. Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV, Genus Begomovirus

12. Účastníci projektu Belgie Bulharsko Česká republika Francie Kypr Nizozemsko Nový Zéland Řecko Velká Británie Koordinátor projektu: Neil Boonham (CSL, VB)

13. Harmonogram projektu:1/ XII.08 – zkušební test2/ III.09 - hlavní část projektu - distribuce primerů avzorků (CSL) a následná validace dodaných diagnostických metod (SRS). 3/ IV.09 - odeslání získaných výsledků do CSL. 4/ léto 09 - shrnutí a vyhodnocení výsledků, statistická analýza atd. (CSL). 5/ podzim 09 - ukončení projektu (závěrečná zpráva) (CSL).

14. Zkušební test - 2008:Účel: prověření schopnosti zúčastněných laboratoří provádět analýzu; ověření funkčnosti metody extrakce nukleových kyselin, PCR a vyhodnocení výsledků, rychlosti dodání výsledků zpět a odhalení možných problémů. Dodaný materiál: - 4 zkušební vzorky pro detekci TYLCV (viru žluté svinutky listů rajčete) ve formě sušených listů (2 slepé vzorky, pozitivní kontrola, negativní kontrola) - primery pro PCR - návrh postupu izolace DNA (možnost použití vlastní používané metody izolace)

15. Postup: - každý ze 4 dodaných vzorků rozdělen na dva dílčí vzorky (vyšší spolehlivost výsledků) Izolace provedena: a) dle dodaného protokolu (CTAB izolace) b) v laboratoři standardně používanou metodou pro izolaci DNA z rostlinného materiálu (Dneasy Plant minikit, Qiagen). Vzhledem k tomu, že TYLCV se na území ČR nevyskytuje, laboratoř nemá rutinně zavedenou metodiku pro detekci tohoto viru. - u všech vyizolovaných vzorků provedena dle požadavků interní PCR kontrola s dodanými primery detekujícími rostlinnou DNA (ověření správnosti izolace DNA a schopnosti amplifikace v reakci) a následně PCR s dodanými primery pro detekci TYLCV. Úspěšnost testu byla 100%.

16. Finanční prostředky požadované pro rok 2008 (15.000,-Kč) byly použity proprovedení celkem 40 PCR reakcí a jejich vyhodnocení agarosovouelektroforézou:4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované CTAB metodou - interní PCR kontrola) 4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované CTAB metodou - PCR detekce TYLCV) 4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované Dneasy kit metodou - interní PCR kontrola) 4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované Dneasy kit metodou - PCR detekce TYLCV) Výše finančních požadavků pro rok 2009 byla stanovena na 30.000,-Kč

17. Následují dvě fotografie výsledků PCR - pro každou metodu izolace jedna. COX je interní PCR kontrola, TYLCV potom specifická PCR pro detekce hledaného viru. 

18. Izolace pomocí DNeasy plant mini kitu

19. Izolace pomocí CTAB

20. Obecné zhodnocení projektů Vyhlášené projekty naplňují poslání Euphresco – účastnické státy řeší výzkumné úkoly společně a koordinovaně - úspora financí - možnost průběžného srovnávání a konečné optimalizace použitých metod v jedinou - možnost konzultací s kolegy, zabývající se stejnou problematikou ve stejném čase - věrohodnost výsledků a jejich snazší přijatelnost

21. Přínos účasti na projektech pro SRS 1/ aktivní účast při ověřování metodických postupů a možnost ovlivnění nových metodik EPPO 2/ získání/prohlubování kontaktů se zahraničními specialisty a zvýšení povědomí o úrovni našich organizací, zabývajících se rostlinolékařstvím 3/ nové informace a postupy, které se mohou stát základem budoucích SOP 4/ získání referenčních materiálů, které lze dále využít jako pozitivní kontroly Poděkování MZe ČR za koordinaci a financování projektu.

22. Vše. Díky!