Enzymologia-5

1. Enzymologia-5 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

2. Najważniejsze metody badania mechanizmów reakcji • Określanie struktury enzymu • Modyfikacja chemiczna enzymu • Ukierunkowana mutageneza genu kodującego enzym • Detekcja intermediatów reakcji enzymatycznej • Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

3. Zastosowanie badań strukturalnych do określania mechanizmów reakcji Metody: niskotemperaturowa rentgenografia strukturalna, NMR Szczególne znaczenie – określanie struktury kompleksu enzymu z analogiem substratu lub analogiem stanu przejściowego Struktura kompleksu hydroksymetylotransferazy serynowej z adduktem substratu z koenzymem oraz analogiem drugiego substratu

4. Reakcja katalizowana przez karbamoilotransferazę asparaginianową Stan przejściowy Analog stanu przejściowego

5. Struktura kompleksu karbamoilotransferazy asparaginianowej z PALA

6. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Działanie na enzym związkiem chemicznym powodującym inaktywację • Dwa podejścia: • odczynniki specyficzne wobec grup funkcyjnych określonych reszt • aminokwasowych; • analogi substratu lub stanu przejściowego reakcji enzymatycznej • zawierające reaktywne ugrupowania chemiczne (ang. affinity labeling) • Cechy odczynnika modyfikującego: • selektywne zablokowanie określonej grupy funkcyjnej • charakter lokalny zmiany • ograniczenie zawady przestrzennej

7. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Pojęcie reszty istotnej dla aktywności enzymu • modyfikacja chemiczna reszty powoduje całkowitą utratę aktywności przez • enzym; • stechiometria inaktywacji 1 : 1; • substrat lub inhibitor kompetytywny chronią enzym przed inaktywacją

8. Kinetyka inaktywacji enzymu ln[Ea]t/[Ea]o kobs [I] < [Io] tga = k1 [Io] [I] > [Io] t [I]

9. kobs [I]

11. Odczynniki reagujące specyficznie z łańcuchami bocznymi niektórych reszt aminokwasowych.

12. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Odczynniki ukierunkowane na reszty cysteinylowe • A. -halogenooctany i -halogenoacetamidy • Warunki: pH  7; labilne w roztworach wodnych; reaktywność I>Br>>Cl; • dla jodopochodnych rekcję należy prowadzić w ciemności • B. N-podstawione imidy kwasu maleinowego • Warunki: pH  7; możliwość śledzenia zaniku absorpcji przy  = 302 nm; • dla NEM  = 620 M-1cm-1

13. C. Kwas 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesowy Warunki: pH = 8.0; niezbyt duże nadmiary molowe odczynnika (1,5  do 2 ); dla wytworzonej S-cyjanopochodnej max = 330 nm,  = 7500M-1cm-1 D. Odczynnik Ellmana – kwas 5,5’-ditiobis(5-nitrobenzoesowy) Używany do ilościowego oznaczania grup tiolowych.

14. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynnik ukierunkowany na reszty serylowe  Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)

15. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty lizylowe A. Imidoestry Warunki: długie czasy reakcji B. Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy Warunki: Barwny produkt podstawienia; max = 420 nm,  = 20 000 M-1cm-1

16. C. Fosforan pirydoksalu Warunki: najwyższa selektywność; wytworzenie trwałego wiązania dopiero w wyniku redukcji zasady Schiffa; reakcję należy prowadzić w ciemności; cyjanoborowodorek preferowany wobec borowodorku bo można prowadzić reakcję w roztworze wodnym (uwaga: tylko w pH >7!)

17. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Odczynniki ukierunkowane na reszty histydylowe • A.Dietylopirowęglan • Warunki: odczynnik specyficzny dla His w zakresie pH4,5 – 7; produkt modyfikacji • absorbuje w UV - max = 240 nm,  = 3200 M-1cm-1; odczynnik nietrwały w roztworach • wodnych; w pH 7 czas połowicznego rozpadu = 10 min; im niższe pH tym większa • trwałość odczynnika

18. B. Róż Bengalski – odczynnik fotoutleniający Warunki: ograniczona specyficzność (możliwe utlenienie Cys, Met i Trp); reakcję prowadzi się w temp 0 - 4C naświetlając promieniowaniem w zakresie VIS

19. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty tyrozylowe A. N-acetyloimidazol Warunki: duże nadmiary odczynnika. Unikać buforu Tris. Reakcja dość wolna  B. Tetranitrometan Warunki: można śledzić postęp reakcji przy  = 350 nm,  = 14.400 M-1cm-1 (anion trinitrokarboniowy). Może zachodzić utlenienie cysteiny.

20. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty tryptofanylowe A. N-bromoimid kwasu bursztynowego Warunki: reakcja w buforze octanowym; gwałtowny przebieg; ograniczona specyficzność (ulegają też Tyr, Cys. Met) B. Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (BHNB) C. Sól dimetylosulfoniowa BHNB odczynnik rozpuszczalny w wodzie Warunki: duże nadmiary odczynnika (nawet 100 ); reakcja w ciemności; odczynnik słabo rozpuszczalny w wodzie

21. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty Glu i Asp A. Rozpuszczalne w wodzie pochodne karbodiimidu Schemat przebiegu reakcji Warunki: reakcja specyficzna w pH 4 – 6; duże nadmiary odczynnika; jako aminę stosuje się najczęściej ester metylowy glicyny; w kwaśnym pH konkurencyjna reakcja hydrolizy jest bardzo wolna.

22. HIS95 HIS95 HIS95 N + H-N + H-N N N N H O O NH3+ NH3+ NH3+ Glu165 Glu165 Glu165 Lys12 Lys12 Lys12 Izomeraza fosfotriozowa

23. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Izomeraza fosfotriozowa

24. Mutageneza ukierunkowana Mutageneza to proces prowadzący do powstania mutacji, czyli dziedziczonej zmiany sekwencji nukleotydowej DNA • Mutageneza ukierunkowana jest techniką umożliwiającą precyzyjne badanie białek: • umożliwia zrozumienie, w jaki sposób białka ulegają fałdowaniu • jak rozpoznają inne cząsteczki, katalizują reakcje. W przypadku ustalania aminokwasów biorących udział w funkcji katalitycznej, czy regulacyjnej enzymu jest to najlepsza metoda udowadniająca lub obalająca udział konkretnych aminokwasów w pełnieniu tych funkcji.

25. Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt • istotnych dla aktywności enzymu • Enzym syntaza GlcN-6-P Struktura przestrzenna enzymu Analiza porównawcza sekwencji syntazy GlcN-6-P z różnych źródeł podstawą selekcji reszt do ukierunkowanej mutagenezy

26. Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt • istotnych dla aktywności enzymu • Enzym syntaza GlcN-6-P Aktywność glutaminazowa: L-Gln + H2O  L-Glu + NH3 Aktywność izomerazowa: Fru-6-P  Glu-6-P Aktywność syntazowa: L-Gln + Fru-6-P  L-Glu + GlcN-6-P

27. Detekcja intermediatów Niektóre produkty przejściowe reakcji enzymatycznej są stosunkowo stabilne (głębokie minimum energetyczne) – istnieje możliwość detekcji metodami spektroskopowymi: spektrofluorymetria, NMR niskotemperaturowy; Początkowe etapy reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę Wyłapywanie intermediatów za pomocą reakcji chemicznej Redukcja produktu przejściowego w postaci zasady Schiffa prowadzi do powstania stabilnego adduktu

28. Informacje dotyczące mechanizmu działania enzymu, które można uzyskać z pomiarów kinetycznych

29. Zależność aktywności enzymu od zmian struktury substratu Papaina – proteinaza cysteinylowa Ala-Phe-Arg Ala-Phe-Arg-Leu Badania specyficzności substratowej papainy wobec syntetycznych oligopeptydów wykazały istnienie w centrum wiążącym substrat obecność 7 „subcentrów” S2 – specyficzne wobec L-Phe S1’ – stereospecyficzne dla L-aminokwasów, z preferencją dla L-Leu i L-Trp Tripeptyd Ala-Phe-Arg jest inhibitorem kompetytywnym enzymu Czy tetrapeptyd Ala-Phe-Arg-Leu jest także inhibitorem?

30. Zależność zmian aktywności enzymu od pH Analiza kształtu zależności v = f(pH) daje możliwość wyznaczenia pKa reszt ulegających jonizacji, które są istotne dla aktywności enzymu Krzywa dzwonowa pH optimum = pKa reszty katalitycznej

31. Analiza zależności pKa reszt jonizujących od polarności rozpuszczalnika pozwala na określenie stanu jonizacji reszty -COO- + H+ -CO2H W tym przypadku obniżenie polarności rozpuszczalnika jest niekorzystne dla dysocjacji. pKa rośnie przy obniżaniu polarności. -ImH+ -Im + H+ A jak w tym przypadku?

33. Kinetyka stanów nieustalonych Schemat aparatury do pomiarów kinetycznych metodą stopped flow

34. Kinetyka stanów nieustalonych • Warunki pomiaru: • stężenia enzymu i substratu na porównywalnym poziomie • techniki pomiarowe umożliwiające określanie niewielkich zmian stężenia w krótkim czasie (ang. stopped flow) Przykład: reakcja wiązania NADH przez dehydrogenazę mleczanową. Pomiar zmian stężenia NADH metodą spektrofluorymetryczną przez 16 ms; Stężenia początkowe enzymu i NADH identyczne – 8 M. k1 E + NADH [E:NADH] k-1 Reakcja II rzędu, ale ponieważ [E] = [S], to połowiczny czas reakcji można wyrazić wzorem:  = 1/k [S]. Z eksperymentu otrzymano  = 2 ms k = 1/ [S] = 6,7  107 M-1 s-1 Ponieważ k1>> k-1, to k = k1

35. Chymotrypsyna – triada katalityczna

36. Kinetyka hydrolizy octanu p-nitrofenylu przez chymotrypsynę Faza I – tworzenie produktu przejściowego - acyloenzymu Faza II – hydroliza produktu przejściowego