Enzymologia-3

1. Enzymologia-3 Metody określania struktury enzymów

2. 1. Określanie struktury I- i II-rzędowej • 1.1 Określanie składu aminokwasowego • i masy cząsteczkowej białka • 1.2 Zastosowanie spektrometrii mas • w analizie białek • 1.3 Sekwencjonowanie białek • 1.4 Identyfikacja wiązań disiarczkowych • 1.5 Spektroskopowe metody określania struktury II-rzędowej

3. Określanie składu aminokwasowego Hydroliza białka do składowych aminokwasów Warunki klasyczne: 6 M HCl zawierający 0.1% phenol, w próżni lub atmosferze azotu, w zamkniętej ampułce, 110 C, 18 – 96 h • Problemy i ograniczenia: • częściowa destrukcja reszt Ser, Thr, Tyr. • Zakłada się 10% destrukcję Ser oraz 5% destrukcję Thr i Tyr w ciągu 24 h, lub przeprowadza się • hydrolizę trzech próbek, odpowiednio przez 24, 48 i 72 h i następnie ekstrapoluje się wyniki dla • momentu zero • reszty Asn i Gln są przekształcane w Asp i Glu. • Białko poddaje się działaniu bis (1,1-trifluoro-acetoksy)jodobenzenu /36 mg/ml in 0.01 M TFA, 4 h, • 60 C, w ciemności/. W tych warunkach reszty karboksyamidowe są przekształcane w aminy • całkowita destrukcja Trp • Konieczne przeprowadzenie osobnej hydrolizy. Warunki: 3 M kwas p-toluenosulfonowy, 110 C, • 24 – 72 h, w prózni

4. Separacja i analiza mieszanin aminokwasów Separacja mieszaniny PTC-aminokwasów metodą HPLC. Wypełnienie: octadecylosilan, elucja mieszaniną acetonitryl /woda Chromatografia jonowymienna mieszaniny aminokwasów. Kolumna Dowex 50WX4 • Derywatyzacja aminokwasów • Analizatory jonowymienne – po kolumnie • Ninhydryna; barwne pochodne, detekcja przy 570 nm • lub 440 nm (Pro); • fluoreskamina lub aldehyd ftalowy + 2-tioetanol; produkty • fluoryzujące; • HPLC w układzie faz odwróconych – przed kolumną • fenylotioizocyjanian; PTC-pochodne • chlorek dansylu; DNS-pochodne • chlorek N-(9-fluorenylometoksykarbonylu; FMOC-pochodne

5. Metody określania masy cząsteczkowej białek • Metody bezpośrednie: • sedymentacja (wirowanie strefowe) • spektrometria mas (MS ESI) • Metody porównawcze: • elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE i natywna) • chromatografia rozmiarów wykluczających

6. Schemat blokowy spektrometru mas

10. Schemat spektrometru MALDI-TOF

11. Sekwencjonowanie białek • Rozszczepienie łańcucha białka na fragmenty metodami • enzymatycznymi lub chemicznymi • Separacja i izolacja peptydów • Sekwencjonowanie peptydów • Określenie kompletnej sekwencji łańcuch białka na podstawie • porównania nakładających się sekwencji peptydów

12. Enzymatyczne metody rozszczepienia białek • Zasady ogólne: • białka należy zdenaturować przed podddaniem ich trawieniu enzymatycznemu • należy używać lotnych buforów (można je usunąć poprze liofilizację) • należy używać enzymów proteolitycznych specjalnej jakości (sequencing grade) • warunki reakcji powinny być zoptymalizowane • Enzymy wykorzystywane do specyficznego cięcia: • Trypsyna – karboksylowa strona reszt Arg, Lys i S-aminoetylocysteiny; specyficzność • można ograniczyć do Arg poprzez modyfikacje reszt lizyny np, bezwodnikiem • kwasu bursztynowego; • Chymotrypsyna – karboksylowa strona Phe, Trp, Tyr and Leu (w kolejności zmniejszającej • się podatności) • Termolizyna – aminowa strona Leu, Ile, Phe, Val • Proteaza V8 zeS. aureus – wiązania Glu-X oraz (znacznie mniej efektywnie) Asp-X • Endoproteinaza Lys-C – wiązania Lys-X

13. Określanie masy cząsteczkowej białka z widma MS ESI Zasada obliczania masy cząsteczkowej A/ Dla dwóch sąsiednich pików jonizacyjnych m1 i m2, gdzie m2>m1 m1 = (M + z1)/z1 m2 = [(M + (z1 – 1)]/(z1 – 1) B/ Podstawiając za m1 i m2 wartości m/z sąsiednich pików, rozwiązujemy układ równań względem niewiadomych M i z1

14. Metody chemicznego cięcia łańcuchów białkowych 1. Indukowane działaniem CNBr rozszczepienie przy resztach Met

15. 2. Rozszczepienie wiązań Asn-Gly działaniem N-hydroksyloaminy Warunki : 6 M chlorowodorek guanidyny, 2 M chlorowodorek hydroksyloaminy, pH = 9.0, w obecności 4.5 M LiOH

16. Sekwencjonowanie białek Degradacja Edmana R O 1 + H N C H C N H C H C N C S 2 O R 2 n-peptyd pH 8 kolejny H N H C H R 1 N C C O S N H C H R 2 C F C O O H 3 O C bezwodny S rozcieńczony N H kwas mineralny N C C H R N H 1 N S C H R 1 O + O fenylotiohydantoina (PTH) R 2 H N C H C (n-1)-peptyd 2 O PITC cykl (DABITC) (DNS) DNS-pochodne aminokwasów można wykryć na poziome fentomolowym Metoda DABITC/PITC DABITC tworzy barwne pochodne z aminokwasami; wysoka czułość, ale tylko 60% efektywność sprzęgania. Metoda DABITC/PITC – każdy cykl składa się z dwóch etapów sprzęgania: DABITC, a następnie PITC

17. Mikrosekwencjonowanie peptydów Możliwość analizy próbek w ilościach nanogramowych

18. Zastosowanie spektrometrii mas do analizy peptydów 1. MS-FAB (Fast Atom Bombardment) Materiał analizowany: peptydy powstające w wyniku rozszczepienia chemicznego lub enzymatycznego, rozpuszczone w 30% kwasie octowym (0.5 – 1 g/l); taki roztwór miesza się z glicerolem (50:50, v/v), Próbka nie może zawierać soli Na próbkę działa się działa się strumieniem atomów Ar lub Xe lub jonami Cs+ (5 – 10 kV); Selekcja jonów:analizator sektorów magnetycznych lub TOF 2. MS MALDI-TOF Materiał analizowany: Mieszaniny peptydów powstające w wyniku traktowania białka kilkoma różnymi enzymami proteolitycznymi (osobne próbki). Zwykle wstępnie blokuje się reszty cysteiny i/lub lizyny. Próbka w matrycy stałej. Złożone widma analizowane są w celu identyfikacji poszczególnych peptydów. Metodę można także stosować do identyfikacji miejsc modyfikacji białek

19. MS-FAB w analizie peptydów Widmo MS FAB peptydu Arg-Pro-Val-Trp-Pro- Asn-Gly-Ala-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe. Mniejszy rysunek – powiększenie obszaru (M + H)+ Sekwencjonowanie białek z zastosowaniem tandemowej spektrometrii MS-FAB

20. Analiza MS MALDI-TOF mieszanin peptydów otrzymanych w wyniku działania chymotrypsyny na enzym, syntazę GLcN-6-P: A – forma natywna; B – forma poddana działaniu inaktywatora lączącego się z enzymem wiązaniem kowalencyjnym Wynik nałożenia obszarów 200 – 800 widm A i B. Sygnałów obecnych w obu widmach nie pokazano

21. Identyfikacja wiązań disiarczkowych • 1. Czy enzym zawiera w swojej strukturze wiązania disiarczkowe? • Należy porównać ruchliwość elektroforetyczną (SDS-PAGE) enzymu poddanego uprzednio • Denaturacji w warunkach redukujących (w obecności merkaptoetanolu) i nieredukujących • 2. Określenie liczby wiązań –S-S- • Przygotować dwie próbki enzymu w roztworze zawierającym 6 M chlorowodorek guanidyny • Poddać próbkę 1 działaniu 10 mM DTT; W tych warunkach ewentualne wiązania –S-S- • ulegają redukcji. Usunąć DTT poprze filtrację żelową. • 3. Miareczkować obie próbki roztworem odczynnika Ellmana. Porównać wyniki.

22. Lokalizacja wiązań disiarczkowych • Utlenianie wiązań –S-S- kwasem nadmrówkowym • Dwukierunkowa elektroforeza bibułowa • Próbke białka poddaje się działaniu jodoacetamidu dla zablokowania wszystkich wolnych grup -SH • Zmodyfikowane bialko poddaje się rozszczepieniu enzymatycznemu. Mieszaninę peptydów dzieli • się na dwie części. • Obie próbki poddaje się separacji elektroforetycznej na bibule w jednym kierunku. • Rozdzielone peptydy na jednej z bibuł poddaje się działaniu par kwasu nadmrówkowego. • W tych warunkach pękają wiązania disiarczkowe, a powsatłe tiole sa utleniane do reszt kwasu • sulfonowego. Reszty –SH, które występowały w natywnym białku w formie wolnej, a w etapie 1 • zostały zablokowane, nie ulegają w tych warunkach żadnej dalszej zmianie. • Obie bibuły zostają poddane powtórnej elektroforezie, w kierunku prostopadłym do poprzedniego. • Po zakończeniu elektroforezy uwidacznia się położenie peptydów w wyniku wywołania ninhydryną • lub fluoreskaminą. • Wyniki poddaje się analizie. Wszystkie plamki obecne na bibule, która nie była poddana działaniu • kwasu nadmrówkowego powinny znajdować się na przekątnej. Jeżeli druga bibuła wyglada identycznie, • to badane białko nie posiadało żadnych wiazań disiarczkowych. Wszystkie plamki znajdujące się • poza przekatną na bibule poddanej działaniu kwasu nadmrówkowego odpowiadają peptydom, które • były połączone wiazaniami –S-S-

23. Określanie struktury II-rzędowej Zastosowanie spektroskopii CD do określania udziału fragmentów o określonej strukturze II-rzędowej w strukturze białka Porównanie rzeczywistego widma CD białka z widmem skonstruowanym na podstawie przewidywania struktury II-rzędowej, którą powinien przyjąć w roztworze łańcuch polipeptydowy białka Widma CD białek o jednorodnej strukturze II-rzędowej

24. -helisa-kartka-zgięciestruktura nieuporządkowana Porównanie wyników przewidywania struktury II-rzędowej białka otrzymanych przy zastosowaniu czterech różnych algorytmów obliczeniowych

25. Przykład struktury białka błonowego Parametry hydrofobowości reszt aminokwasowych Profil hydrofobowości białka błonowego