“ Cursos de capacitaci ó n y actualizaci ó n para la prevenci ó n y vigilancia de EETs”

1. Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de los animales Laboratorio de Referencia para EET de los Animales Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agrícolas - INTA Castelar “Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”

2. Origen de la EEB

3. Hipótesis sobre el origen • Scrapie • Garrapatas, organoclorados???? • Enfermedad espontánea???? • Origen exótico???? • Origen humano???? (Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005). ? • Scrapie

4. Scrapie: enfermedad genética? Ovino: gen Sip sA/sA 150-200 días sA/pA 300 días pA/pA PRNP 1936: Transmisión experimental de Scrapie

5. Agente etiológico

6. Características del agente de EET -Hay cepas -Barrera de la especie -Tamaño similar a virus -No hay respuesta de anticuerpos -Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas) -Sensibilidad parcial a proteasas -Ácido nucleico? (tiempo de incubación, lesiones SNC)

7. Modelo de agente de TSE Debe explicar -Falta de respuesta de anticuerpos -Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones) -Barrera de la especie (transmisión estocástica)

8. Inactivación del agente de EEB Calor húmedo 121 ºC, 1 atm, 20 min Incompleta 133 ºC, 3 bar, 20 min Calor seco 138 ªC Incompleta Métodos químicos Hidróxido de Sodio 1N, 24 hs Hidróxido de Sodio 2N, 2 hs Hipoclorito de Sodio 12 hs

9. Agentes hipotéticos de "Scrapie" • Virus Lentos No convencionales • "Virino“ • Agentes no convencionales • PRIONES Hipotéticos

10. Alper et al., BBRC 22: 278 (1966) Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967) Griffith, Nature 215: 1043 (1967) Merz et al., Acta Neuropathol 54: 63 (1981) SAF: Scrapie Associated Fibrils

11. Priones “Pequeñas partículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos” PrP PrPC: proteína normal del huesped PrPSc: proteína patogénica de Scrapie Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982

12. Isoformas de PrP Proteinasa K Detergente - Normal PrPC(33-35 kD) Asociada a enfermedadPrPSc(33-35 kD) PrP27-30(27-30 kD) + - +

13. Isoformas PrPC y PrPSc C Sc PrP PrP Detergentes soluble insoluble Proteasas sensible resistente (PrP27-30) -hélice (%) 30  42 3 43  (%) hoja

14. Modelo de nucleación-polimerización (Equilibrio entre las dos isoformas) PrPC PrPSc Incorporación de monóméros PrPSc (rápida) Núcleo infeccioso Nucleación (muy lenta) Estructura amiloide Fragmentación en núcleos infecciosos

15. Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Tiempo de incubación Años Diagnóstico preclínico No Prevención No Signos clínicos Neurológicos Tratamiento No Cura No Evolución Rápida Desenlace Fatal Diagnóstico definitivo Post mortem PrP

16. NH COOH Prusiner, Science 278: 245 (1997) ?

17. Polimorfismos en PrP animales Scrapie: 95% QQ171 Ovino Caprino 171 108 136 142 154 189 86 Q L A H T I Octapéptidos R R V M F V H Bovino Murino ELW/00

18. Esquema del gen PRNP de los ovinos

19. 136 141 154 171 • Valina (V) Fenilalanina (F) Arginina (R) Arginina (R) • Alanina (A) Leucina (L) Histidina (H) Glutamina (Q) • Histidina (H) Polimorfismo del gen PRNP

20. Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP

21. Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por resistencia / susceptibilidad genética

22. P C R PCR - ELISA Secuenciación Manual o Automática Determinación de genotipos PCR - RFLP

23. Determinación de las frecuencias de genotipos

24. Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos

25. Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo

26. Cepas de Scrapie • 20 definidas por pasaje en ratón - Nor 98: aislada de casos de campo: Definida por: - Clínica - Histopatología - “R” en 171: susceptible

27. 2) Francia: Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 3) Japón?? Cepas de BSE 1: Italia BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004

28. “Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities between BSE and an experimental isolate of natural scrapie, CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999 “Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases” Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

29. Diagnóstico de EET

30. Solamente en el post mortem • “Test del tercer párpado” (in vivo) para “scrapie”

31. -Histopatología -Detección de PrP: Inmunohistoquímica SAF Western Blot ELISA

32. Histopatología (Lesión espongiforme) Inmunohistoquímica (Depósitos de PrP)

33. En ovinos SAF: Scrapie Associated Fibrils

34. Medula Oblongata (Región del Obex) 1) Médula espinal 2) Cerebro 3) Región del Obex 4) Area utilizada para WB/ELISA 5) Muestra de elección

35. Tests rápidos BSE -Prionics Check Western -Prionics LIA -TeSeE (BioRad) -CDI InPro - CediTect BSE Test - Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation - IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA - Institut Pourquier Speed´it BSE - Prionics Check PrioSTRIP - Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit - Roche Applied Science PrionScreen • Scrapie • - IDEXX Herdchek • - InPro CDI-5

36. Métodos de referencia: -Histopatología -Inmunohistoquímica -Western blot Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de Argentina • Test rápidos: • -Western blot (Prionics) • - Enfer TSE (ensayo piloto-2003)

37. Algunos métodos en estudio (in vivo) • Detección de PrPSc en sangre (Scherr et al.,J. Chromat697: 223, 1997) • Unión de PrPSc a plasminógeno en soporte sólido (Fischer et al., Nature 408: 479, 2000) • Detección de PrPSc en orina (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001) • “Protein misfolding cyclic amplification” (Saborio et al. Nature 411: 810, 2001) • Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre ( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005)

38. Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animales B. J. Carrillo F.J. Blanco Viera E. L. Weber M. Alegre F. Capellino F. Delgado S. Duffy D. Funes L. Jiménez E. León A. Marcos S. Martínez G. Pinto C. Soto C. Vallejos C.Hirschvogel A. Marcos G. Figueroa S. Carceller A. Elisei Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas Castelar

39. GRACIAS