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Produção de proteínas em bactérias

Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II. Produção de proteínas em bactérias. Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br. 06 de abril de 2010. DNA recombinante

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Produção de proteínas em bactérias

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  1. Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br 06 de abril de 2010

  2. DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

  3. Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? • Estudos bioquímicos • Determinação da estrutura 3D • Aplicações biotecnológicas • - Terapia • - Vacinas • - Diagnóstico... • Alternativa para as seguintes limitações: • Quantidade • Dificuldade de purificação a partir do tecido original • Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) • Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas • Processo completamente controlado • Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

  4. Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

  5. Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

  6. Produção de proteínas recombinantes em bactérias Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

  7. Engenharia genética X expressão heteróloga 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparo do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

  8. Vetores de Expressão • Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG • Sítio de múltipla clonagem (polylinker) • Promotores induzíveis (controle da expressão) • Sinais de secreção • Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)

  9. Vetor de expressão em E. coli RBS ou sequência de ShineDalgarno

  10. Regulação da expressão gênica – controle da expressão Operon Lac

  11. Vetores da família pET (Novagen) • Altos níveis de expressão • Promotor T7 é mais forte que o lac • Controle rigoroso pelo lacO • Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3) IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

  12. Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE não induzidas Proteína recombinante de 70 kDa induzidas com IPTG

  13. Produção de proteínas recombinantes em bactérias (sistema pET)

  14. Vetor de expressão com cauda de histidina

  15. Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose • Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

  16. Minimizar a proteólise • Maximizar a expressão • Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) • Facilitar o folding • Solubilidade

  17. Algumas companhias que comercializam vetores de expressão http://www.promega.com http://www.neb.com http://www.stratagene.com http://www.invitrogen.com

  18. Produção de insulina recombinante (Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation) • Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos; • Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais; • Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes. Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana Cadeia β Cadeia α Seq sinal Peptídeo C Preproinsulina Clivagem da sequência sinal de secreção Cadeia α Cadeia β Cadeia α Peptídeo C Ligações dissulfeto Proinsulina Cadeia β Clivagem do peptídeo C Insulina funcinal

  19. Obtenção de insulina recombinante

  20. Algumas proteínas recombinantes disponíveis • para terapia humana • Insulina (rhI); • Hormônio do crescimento (rhGH); • Hormônio folículo estimulante (rhFSH); • Fator VIII (rhFactorVIII); • Eritropoetina (EPO); • Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF); • N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB); • DNAse • Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA); • Glicocerebrosidase (rhGBA); • Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama); • Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

  21. Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli

  22. Trabalho complementar * Formar grupos com 4 componentes* Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de proteína heteróloga em E. coli* Entregar até 12-04-10 - Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante

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