Travail réalisé au LEM à l’Institut de Biologie Structurale Grenoble Présenté par: Elodie Crublet

1. Caractérisation de l’interaction entre la glycoprotéine d’enveloppe gp120 du VIH-1 et les héparanes sulfate : importance des changements conformationnels induits par la liaison à CD4 Travail réalisé au LEM à l’Institut de Biologie Structurale Grenoble Présenté par: Elodie Crublet sous la responsabilité de: Hugues Lortat-Jacob Romain Vivès

2. Les héparanes sulfate

3. Les protéoglycanes à chaîne d’héparane sulfate -HSPG- Chaîne d’héparane sulfate (HS) Core protéique

4. Le glycocalix: une interface entre la cellule et l’extérieur 1 unit = 7.2 μm Stevens et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, in press (may 2007) Marquage fluorescent des HS à la surface d’un tapis de 10 cellules endothéliales de poumon (*)

5. Structure des héparanes sulfate 6-O-SO3- 3-O-SO3- 2-O-SO3- N-SO3- COO- OH O O O O HO HO OH Ac-N O [acide hexuronique (GlucA ou IdoA) et N-acétyl glucosamine] n n n = 20 à 100 48 disaccharides différents 48² = 2304 : tétrasaccharides 483 > 105 : hexasaccharides 484 > 5.106 : octasaccharides 485 > 2.108 : décasaccharides 486> 1010 : dodécasaccharides... Grande hétérogénéité et diversité structurale considérable

6. Organisation structurale des héparanes sulfate 6-O-SO3- COO- OH COO- OH O O O O O O O HO O HO HO HO OH Ac-N OH O Ac-N O 3-O-SO3- 2-O-SO3- N-SO3- domaine NA domaine NS Régions N-Acétylées, peu sulfatées Régions N-Sulfatées hautement sulfatées

7. Fonctions des héparanes sulfate • Facteurs de croissance • Cytokines • Chimiokines • Molécules d’adhésion • Protéines de la matrice • Enzymes • Inhibiteurs d’enzymes • Agents pathogènes • ... • Prolifération • Différenciation • Migration • Adhésion • Cohésion tissulaire • Voies métaboliques • Coagulation • Infection • ...

8. Fonctions des héparanes sulfate: Récepteur d’ancrage pour des pathogènes HSPG HSPG HSPG Cellule cible • Des bactéries • Des parasites • De nombreux virus • Adenovirus 2 et 5 • Adeno-associated virus • Cytomegalovirus • Flavivirus (Dengue, Yellow fever, Hepatitis C) • Foot-and-mouth disease virus • Herpes simplex virus I et III • Human immunodeficiency virus (VIH) • Papilloma virus • Pseudorabies virus • Respiratory syncytical virus • Sindbis virus • Vaccine virus… Infection en cis FMDV, HIV, Ad-2, Ad-5, AAV… Infection directe HSV-1 Infection en trans HIV

9. Le Virus de l’Immunodéficience Humaine

10. Le Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise Définition • Agent responsable: le VIH • Attaque du système immunitaire • Lymphocytes T • Monocytes • Macrophages Donnéesépidémiologiques 33,2 millions de personnes séropositives (2007 - ONUSIDA)

11. Structure du VIH

12. gp41 gp120 CD4 CD4i CD4i Corécepteur Mécanisme de l’entrée virale CXCR4 CCR5 Virus R5 Virus X4 Virus R5X4 Monocytes Macrophages Corécepteurs et tropisme viral Lymphocytes T Cellule Source: Boehringer Ingelheim

13. La glycoprotéine virale gp120 Domaine interne Domaine externe Stephen Harrison http://www.childrenshospital.org binding to the CD4 receptor Kwong et al., Nature, 1998 Structure de gp120 en complexe avec un fragment de CD4 et de 17b Feuillet intermédiaire

14. Les récepteurs alternatifs

15. Le rôle des héparanes sulfate dans l’infection par le VIH

16. Les HS participent à l’attachement du VIH Trans infection cellule CD4+ cellule CD4- (épithéliale) Cis infection (?) (?) Barrière hématoencéphalique Argyris et al., J. Virol., 2003 Bobardt et al., J. Virol., 2004 Transcytose Saphire et al., J. Virol., 2001 Bobardt et al., Immunity, 2003

17. Que connaît-on sur l’interaction virus/HS? Fin des années 80: l’héparine inhibe le VIH, in vitro Baba et al., Antimicrob Agents Chemother, 1988 virus X4 (MN) virus R5 (JRFL) Seuls les virus X4 fixent l’héparine Depuis : composés polyanioniques testés pour inhiber le VIH Lortat-Jacob et al., Virologie, 2005 Vivèset al., J. Biol. Chem, 2005 Moulardet al., J. Virol., 2000 résultats mitigés Héparine Héparine gp120 interagit avec les HS via sa boucle V3 Virus R5 Boucle V3 basique (< +5) Virus X4 Moulardet al., J. Virol., 2000 Expériences de destruction des HS cellulaires Roderiquezet al., J. Virol., 1995 Boucle V3 très basique (+7 à +10)

18. Le site de fixation aux corécepteurs (CD4i) interagit avec les hs Lys 432 Lys 121 Arg 419 Lys 421 Boucle V3 X4 Vivèset al., J. Biol. Chem, 2005 Moulardet al., J. Virol., 2000 gp120 + CD4 gp120 R5 CD4i, site de fixation aux corécepteurs 100 gp120 80 gp120/CD4 60 40 gp120 20 0 0 500 1000 1500 Temps (s)

19. Hypothèse de travail CD4i HS Les HS pourraient inhiber l’interaction gp120/corécepteur Objectifs Approfondir les connaissances sur l’interaction gp120/HS Confirmer le rôle de CD4i dans l’interaction et déterminer les résidus impliqués

20. Plan Production et purification de gp120 et de ses formes mutées Production et purification de gp120 et de ses formes mutées Caractérisation fonctionnelle de gp120 • BIAcore • Tests cellulaires (chimiotaxie) Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques d’interaction avec l’héparine • Principe • Exemple de résultats: la chimiokine RANTES • Optimisation: élimination du support solide • Application à gp120 Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée

21. Production de gp120 en cellules d’insectes -Système baculovirus- • Cellules d’insectes • Cellules S2 de drosophiles • Technologie « Baculovirus »

22. Production de gp120 en cellules d’insectes -Système baculovirus- st 0h 24h 48h 72h 96h 130 – 100 – 72 – 55 – 130 – 100 – 72 – 24h 48h 72h 96h 120h 110 – Sf9 Sf21 110 – HF 110 – Optimisations Séquence signal Type cellulaire melittine egt Production en mini fermenteur (1L) infection de cellules Sf21 pendant 72h 25 à 30 mg/L

23. Purification de gp120 mAU 600 10 12 14 16 18 20 22 24 400 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 34 – 200 0 mAU 200 150 100 50 0 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 0 10 20 30 40 50 60 mL 0 5 10 15 20 mL 10 11 12 13 14 15 16 7 18 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – Echangeuse d’ions SP sépharose Affinité Lentil lectine Exclusion Superdex 200 Superdex 200 Rendements 1 à 2 mg de protéine purifiée/L

24. Plan Production et purification de gp120 et de ses formes mutées Caractérisation fonctionnelle de gp120 • BIAcore • Tests cellulaires (chimiotaxie) Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques d’interaction avec l’héparine Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée

25. Caractérisation fonctionnelle de gp120 eq ass diss BIAcore Response (RU)

26. Caractérisation fonctionnelle de gp120 CD4 Y 17b gp120 17b: anticorps anti-CD4i 200 nM gp120+CD4 100 nM 50 nM gp120 17b CD4 Kd: 8 nM gp120 interagit avec CD4. Cette interaction induit l’exposition du site de fixation aux corécepteurs (CD4i)

27. Caractérisation fonctionnelle de gp120 -Interaction gp120/CXCR4 et signalisation- 80 70 60 50 % migration 40 30 20 10 0 (nM) 0,3 3 2 20 200 2 20 200 Chimiotaxie Insert Transwell Cellules CXCR4+ Chambre supérieure Membrane poreuse SDF-1 ou gp120/CD4 Chambre inférieure gp120 HXBc2 (labo)/ CD4 (200 nM) gp120 LAI/ CD4 (200 nM) SDF-1a Cell. d’insectes Cell. mammifères gp120 n’induit pas les voies de signalisation en aval de CXCR4

28. Plan Production et purification de gp120 et de ses formes mutées Caractérisation fonctionnelle de gp120 Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques d’interaction avec l’héparine • Principe • Exemple de résultats: la chimiokine RANTES • Optimisation: élimination du support solide • Application à gp120 Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée

29. Etude des domaines protéiques d’interaction avec l’héparine Séquençage N-terminal Héparine Principe de la méthode des « billes » Vivès RR. et al., J. Biol.Chem., 2004 Crublet E. and Vivès RR., New developments in therapeutic glycomics, 2006

30. Exemple de résultats: RANTES (9-68) Domaines basiques “méthode des billes” PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS Digestion à la thermolysine RANTES (9-68)~300nM PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS

31. Modulation des concentrations protéiques PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS

32. Identification de nouveaux résidus PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS

33. Détermination des domaines d’interaction d’autres protéines • Glycoprotéine d’enveloppe gC du virus de la pseudo rage • Fragmenta3LG4/5 de la laminine-5, protéine matricielle

34. Alternative: étude en solution Principe BUTS - s’affranchir du support billes - choisir des oligosaccharides de taille et de structure définies B Héparine ou oligosaccharide Purification des complexes peptides/héparine sur une résine de DEAE

35. Etude des domaines de gp120 engagés dans l’interaction avec l’héparine MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTS IRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGF AILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQ REKR V3 MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR 

36. Etude des domaines de gp120 engagés dans l’interaction avec l’héparine C Site de clivage (Furine) gp120 gp41 KIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRXXXXX V1/V2 V3 • Participation à l’attachement du virus aux HS des cellules (virus Sindbis) • proche du site CD4i • réarrangements structuraux sous l’influence de CD4, aboutissant à l’exposition de CD4i CD4i V1/V2 C-ter • Site d’interaction avec les HS déjà caractérisé (Arg298) • Impliquée dans le choix du corécepteur V3 • Rôle dans le clivage de gp160 en gp120 et gp41. • Interaction C-ter/héparine nécessaire au clivage C-ter

37. Plan Production et purification de gp120 et de ses formes mutées Caractérisation fonctionnelle de gp120 Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques d’interaction avec l’héparine Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée

38. Etude des résidus de CD4i interagissant avec l’héparine Lys 432 Lys 121 Arg 419 Lys 421 wt 121 419 421 432 2M 3M 4M • 180 – • 130 – • 100 – 2M: R419S-K421S 3M: K121S-R419S-K421S 4M: K121S-R419S-K421S-K432S

39. Etude de l’interaction gp120/héparine par analyse directe Héparine

40. Etude de l’interaction gp120/héparine par analyse indirecte Y 17b

41. Conclusion • Développement de systèmes de production et purification • Baculovirus: système optimisé pour la production de gp120 • Purification en trois étapes: protéine pure à 90-95% • Mise au point d’une méthode permettant d’identifier les domaines d’une protéine interagissant avec l’héparine • Détection simple et rapide de domaines d’interaction • Nombreuses protéines testées: • RANTES, gp120, gC, laminine, Adam12, prp, AT-III… • Identification des domaines d’interaction de gp120 avec l’héparine • boucle V3 (K305) • Site CD4i (R419, K421et K432) • Deux autres domaines • V1/V2 (K168) • C-ter (K499)

42. Perspectives CD4 CD4 CD4 CD4i HS • Caractérisation structurale et fonctionnelle des domaines V1/V2 et C-ter • Etude de l’interaction gp120/corécepteurs • Etude des motifs saccharidiques de l’interaction gp120/sucre • Etude du rôle physiologique des HS dans l’infection des cellules cibles • Existence de cluster corécepteurs/HS? • Infectiosité de virus mutés sur CD4i? • Développement d’un inhibiteur de l’entrée virale, dérivé des HS

44. INSTITUT PASTEUR, Paris • F. Arenzana-Seisdedos • P. Rueda Quero • F. Baleux • Les Gagophiles • Hugues • Romain • Rabia • Pascal • Stéphane • Cédric • CERMAV, GRENOBLE • A. Imberty • UNIVERSITY OF OXFORD • Q. Sattentau • Le LEM Canal Historique • JP Andrieu • Evelyne GOUT • Isabelle BALLY • Et tous les autres… ANRS Sidaction Mes Amis et Ma Famille…