Total RNA

1. Total RNA Reverse transcriptase

2. Ribonucleic acid (RNA) # 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U)의 4종의 염기를 포함하는 뉴클레오티드가 포스포디에스테르결합으로 외가닥사슬모양 중합체를 형성한 폴리뉴클레오티드가 RNA이다. 약알칼리나 Rnase에 쉽게 분해된다. RNA 분리가 DNA보다 더 주의를 요하는 이유는 세포가 분쇄되자 마자 세포내에 비활성 상태였던 Rnase가 활성화 되기 떄문이다. 더구나 실험자의 손에 묻은 땀이나 타액에 다량의 Rnase가 함유되어 있기 때문에 RNAse오염에 주의해야한다. RNA의 종류는 기능에 따라 리보솜을 구성하는 rRNA(분자량 3만~2백만), mRNA(분자량 5만~5십만), tRNA(분자량 2만5천)로 구별된다. 세포 내에 대부분의 RNA는 rRNA이고, tRNA가 그 다음이며, mRNA는 수% 이하에 불과하다. 실험 목적에 따라 Total RNA를 모두 분리하거나 mRNA만 정제하여 추출 한다.

3. RNA 연구 # 세포는 외부의 자극에 따라서 분화하거나 반응을 하게 된다. 한 개체의 모든 세포의 유전정보는 동일한데 어째서 세포의 모양이나 기능이 다른가? 바로 세포마다 발현하는 단백질이 다르기 때문이다. 유전정보는 DNA-> RNA-> 단백질 순서로 전달되므로( central dogma) 단백질 발현 차이는 mRNA 발현 차이기 때문이다.그렇기 때문에 특정 mRNA의 발현양을 분석하는 것이 중요한 것이다. # 옆 그림과 같이 차이가 있는 두 세포의 RNA를 분리해서 그 차이를 비교하려 할 때.total RNA를 분리해서 전기영동 해보면 차이가 없다(밴드 2개만 보임). 확인되는 밴드는 rRNA인 28s와 18s다. 우리가 관심 있는 mRNA는 전체 RNA의 1% 정도기 때문에소량의 mRNA를 확인할 방법이 필요하다.mRNA를 확인하는 실험은 크게 2가지다. 1. Northern blot hybridization 2. RT-PCR

4. RT-PCR # RT-PCR은 사실 RNA로부터 cDNA를 만들어 cloning하는 쪽으로 더 많이 쓰는 방법으로 말 그대로 RT를 사용해서 PCR로 mRNA를 증폭시켜 검출하는 것이다. 아래 사진을 보면 total RNA의 차이가 없는 4개의 그룹에서 특정 mRNA를 타깃으로 RT-PCR을 하여 전기영동하면 2,4번 샘플에 많이 검출되었음을 확인할 수 있다. # RT란 Reverse transcriptase 의 약자다. PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA-dependent DNA polymerase)이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 할 경우,RNA를 주형(template)으로 하고 여기에 상보적 DNA를 합성하는 효소를 (RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리해서일단 DNA로 복사한 다음 증폭한다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR(Revere Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)이라고 한다.

5. # 맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역전사 한다. RNA는 single strand이기 때문에 primer는 downstream primer뿐이다. 그후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다. # downstream primer는 다음과 같은 세가지 종류가 있다. mRNA 뒤에 poly(A) tail이 붙는 것을 응용한 oligo(dT) primer, gene specific primer, 그리고 여기저기 붙는 random primer다.Oligo(dT) primer를 쓰면 분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어진다. Gene specific primter를 사용하면 target gene만 cDNA로 만들어진다. 그리고 random primer(주로 hexamer)는 염기서열이 일정치 않지만 길이가 고정된 primer다. 이런 primer를 넣고 반응시키면 길이도 다양하고 모든 RNA(rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로 만들어져서cDNA pool이라고 부른다.

6. Trizol #Trizol은 원리와 과정은 아래 그림과 같다. AGPC(Acids guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extract)법 원리를 따라 Trizol reagent에는 monophasic phenol(단백질층 분리 목적)이 guanidinium thiocyanate(Rnase 저해제)와 함께 들어있다. 세포를 깬 후 chloroform 또는 BCP라는 시약을 첨가하면 비로소 층이 갈리게 되는데, 상층액에 분리된 RNA를 침전시키면 된다.

7. 실험: total RNA 분리 • 재료 및 장비 • - 3.5ml dish(cell 배양) • - Trizol(실온보관) • - RNase free tube • - Filter tip • - Chloroform(실온보관) • - Isopropyl alcohol(실온보관) • - 70% ethanol(-20℃보관) • - RNase free dH2O • - 원심분리기 • - 파이펫(1000, 200), tip(blue, yellow) • Vortex Mixer • Spectrophotometer

8. (2) 실험방법 Homogenization ① 3.5 dish에 꽉 채워 키운 세포에 Trizol 1ml을 넣고 강하게 vortexing한 후 실온에서 5분간 반응시킨다 Notice!주위 환경의 RNase contamination 방지하기 위해서 시약에 DEPC라는 RNase inhibitor를 처리한다. 용기는 대개 1회용을 쓰고, 어쩔 수 없는 경우 autoclave하고 또 장갑을 착용하고 RNA work 만을 위한 용기를 쓴다) -참고- #배양세포RNA를 분리하는 방법은 우선 그림과 같이 세포를 모으고 (cell harvest ) PBS로 washing을 거쳐 tube에 모은다. # 조직을 쓰는 경우에는 이런 정도로 세포가 파괴되지 않기 때문에 세포를 갈아준다. - 조직을 liquid nitrogen을 이용해서 동결시킨다음 막자사발에 놓고 가는 방법 - Glass homogenizer를 이용해서 가는 방법 - Polytron homogenizer를 이용해서 가는 방법

9. RNA층 분리 ② 200μL chloroform을 첨가하고 vortexing한 후 실온에서 2-3분간 반응시킨다. ③ 12000xg, 15분간 4℃에서 원심분리해서 새 튜브에 상등액만 옮긴다. RNA 침전 ④ 200μL isopropyl alcohol을 넣고 상하로 흔들어 실온에서 10분간 반응시킨다. ⑤ 12000xg, 10분간 4℃에서 원심분리한 후 육안으로 하얀색 침전물(pallet)을 확인한다. RNA 세척 ⑥ 상층액을 쏟아내고 70% cold ethanol을 튜브 반대쪽 벽면에 뿌려서 침전물이 세척(washing)되도록 한다. ⑦ 뒤집어서 말린다. RNA 수득 ⑧ 50 μL RNase free dH2O 로 수득 후 -80℃ Deep freezer에 보관