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Anne-Laure RAFFIN

Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique. Soutenance de thèse : 5 Juin 2009. Anne-Laure RAFFIN. Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques. Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO. PLAN. Introduction

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  1. Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique Soutenance de thèse : 5 Juin 2009 Anne-Laure RAFFIN Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO

  2. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  3. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  4. Introduction: la réparation de l’ADN L’ALTÉRATION DE LA MOLÉCULE D’ADN Lésion de l’ADN Source de dommages Double hélice d’ADN ADN lésé Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  5. Apoptose Introduction: la réparation de l’ADN LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE L’ADN Source endogène ou exogène de dommage cellule Lésions de l’ADN Arrêt réplication Arrêt de la transcription Réparation de l’ADN Mutagénèse • Restauration de la séquence d’ADN • Reprise du cycle cellulaire Cancérogenèse Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  6. Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X C G A CH3 (CH3)n U X X T T Coupure double brins Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine O6 methyl guanosine Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  7. Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X C G A CH3 (CH3)n U X X T T Coupure double brins Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine O6 methyl guanosine Petites lésions:modifient la structure chimique des composants de l’ADN mais ne déforment pas la double hélice Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  8. Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN Site abasique Adduits volumineux Pontages intra et inter-brin mésappariement X X X X X X C G A CH3 (CH3)n U X X T T Coupuredouble brins Uracile Modification de la base Alkylation Dimère de Pyrimidine O6 methyl guanosine Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de l’ADN et déforment la double hélice Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  9. Introduction: la réparation de l’ADN LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE L’ADN BER NER NHEJ / HR MMR DR X X X X X X C G A CH3 (CH3)n U X X T T BER: Base Excision Repair NER: Nucleotide Excision Repair NHEJ: Non-Homologous End joining HR: Homologous Recombination MMR: MisMatch Repair DR: Direct Reversal Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  10. NER BER Base Excision Repair Nucleotide Excision Repair GG et TC-NER Glycosylases Reconnaissance du dommage XPC, (XPE), XPA and TFIIH Glycosylases + AP endonucléase Excision du dommage Endonucléases XPG et XPF-ERCC1, XPA Resynthèse de l’ADN Polymérase β + Polymérases δ, ε Polymérases δ, ε, RPA, XPA? Ligase III ou I Ligature Ligase I Introduction: la réparation de l’ADN LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  11. Introduction: la réparation de l’ADN LES ADN N-GLYCOSYLASES ET L’APE1 • Substrats: petites lésions de l’ADN • Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique • Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de dommages • Exemple d’ADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG) • Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la liaison phosphodiester Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  12. Introduction: la réparation de l’ADN LES RÔLES DE XPA ET XPC • Substrats: lésions volumineuses de l’ADN • XPC: • Spécificité d’intervention: uniquement réparation globale du génome • Fonction: Reconnaissance de l’ADN endommagé (1er facteur à intervenir) • XPA: • Spécificité d’intervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la transcription • Interactions avec d’autres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA • Fonction(s): « Chef d’orchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la resynthèse de l’ADN • = Rôle complexe qui reste encore à clarifier Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  13. Introduction: la réparation de l’ADN LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION BER NER • Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) • XPC stimule activité de la TDG(Schimizu et al., 2003), OGG1(d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) • hHR23 (A et B) stimule MPG(Miao et al., 2000) • RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) • XPG stimule NTH1(Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) • Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

  14. Introduction: la réparation de l’ADN LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION BER NER • Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) • XPC stimule activité de la TDG(Schimizu et al., 2003), OGG1(d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) • hHR23 (A et B) stimule MPG(Miao et al., 2000) • RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) • XPG stimule NTH1(Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) • Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)

  15. Introduction: le Xeroderma pigmentosum LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM • 1968: relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968) • 7 groupes XP (A à G): déficience d’une protéine de la NER + XPV • Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge • Apparition cancer: risque multiplié par 1000. Tumeurs de la peau vers l’âge de 8 ans (Daya-Grosjean et al. 1995) • Certaines formes: troubles neurologiques • Espérance de vie: 15-20 ans (XP classiques)(de Boer and Hoejmakers 2000) • Pas de traitement • Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  16. Vision minimaliste de la réparation de l’ADN: une lésion étudiée à la fois Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir d’un seul lysat cellulaire Introduction: Les outils pour étudier la réparation LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  17. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  18. Objectifs LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE • Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à l’UDS • Fiabilité • Rapidité • Sensibilité • Peu de cellules • Utiliser l’outil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de réparation de l’ADN de lignées XP • Etudier la réparation de l’ADN de lignées XPA et XPC • Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique • Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  19. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  20. Tampons ioniques Protéines dosage Test in vitro de la réparation Matériels et Méthodes LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES 3 à 5 x 106 cellules (Test en solution de Wood et al.: 109 cellules) Congélation DMSO+SVF+milieu Fibroblastes SV40 de patients XP Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  21. lésions plasmide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 Excision des lésions + Resynthèse Gain de fluorescence Matériels et Méthodes [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION Puce Plasmide Puce Oligo Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  22. AT CTAGCATGGCC Adduits Cisplatine G G NH2 Pt TACGA CGT CCGG NH2 Sites abasiques T-T CPD + 8oxoGuanine Diols de pyrimidine O H O H 6-4 PP O H N N N + N O N N N N N N R R Bases alkylées Photoproduits Matériels et Méthodes LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  23. Part relative de l’intensité de fluorescence des différentes lésions Soustraction du contrôle Somme des Intensité de fluo pour la même lésion Profil d’ER (Excision-Resynthèse) Matériels et Méthodes PARAMÈTRES MESURÉS Quantification de la fluorescence totale Phénotype de réparation Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  24. lésions plasmide surface de la biopuce fluorophore Cy3 lésions oligonucléotide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 incubation avec lysat cellulaire Excision des lésions + Resynthèse Excision des lésions Perte de fluorescence Gain de fluorescence Matériels et Méthodes [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION Puce Plasmide Puce Oligo Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  25. Matériels et Méthodes LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO • - NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine • NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine • UNG: Uracile (U-A ou U-G) • SMUG1: Uracile (U-A ou U-G) • TDG: Mésappariement G-T • MBD4: Mésappariement CG-GT • MPG: Ethénoadénine • APE1: THF (équivalent site abasique) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  26. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  27. Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1) Lysat témoin 0,3 mg/mL • Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions Phénotype XPC ≠ Phénotype Témoin Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  28. Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2) Lysat témoin 0,3 mg/mL Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 ≠ Rünger et al., 1995) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  29. Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE L’ADN DE LYSATS TOTAUX Lysat témoin • ER XPC = 85 % du témoin • ER XPA = 100 % du témoin La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  30. Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1? Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE D’EXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES - Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour l’excision des diols de thymine Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  31. Résultats: Niveau basal de réparation CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION • Niveau basal + concentration standard de protéines • XPC < Témoin • XPA = Témoin • XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions • BER et XPA? ? Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de l’information Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  32. Résultats: Effet d’une irradiation UVB PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence) 0, 5 et 20 J/m² 24 h Cycle cellulaire (Cytométrie en flux) Réparation de l’ADN (test in vitro d’ER) Cytotoxicité (test MTT) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  33. Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  34. 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB 0J/m² 20J/m² ** ** Fibroblastes ** * * * * ** ** ** ** 20J/m² 20J/m² 0J/m² 0J/m² Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  35. 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² 5 J/m² Résultats: Effet d’une irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB ** ** Fibroblastes ** * * * * ** ** ** ** • Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB • XPC  XPA Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  36. Résultats: Effet d’une irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Stimulation Inhibition Après l’irradiation UVB des cellules : • Stimulation de l’ER avec le lysat nucléaire témoin Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  37. Résultats: Effet d’une irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Stimulation Inhibition Après l’irradiation UVB des cellules : • Peu ou pas d’effet de l’irradiation sur la réparation des lysats XP Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  38. Résultats: Effet d’une irradiation UVB CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin • UVB + concentration standard de protéines • Stimulation des activités d’ER avec le lysat nucléaire témoin • Pas de stimulation pour les lysats XP • Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules • Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008) • Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à l’irradiation UV Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  39. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  40. Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1) Lysat nucléaire témoin 0,9 mg/mL protéines 0,3 mg/mL protéines • Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique) Mécanismes différents suivant la concentration? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  41. Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2) Lysat nucléaire témoin 0,3 mg/mL 0,9 mg/mL Augmentation de la part relative d’ER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  42. Lysat XPA Lysat témoin • Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL (sauf pour les diols de pyrimidine) Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP Lysat XPC Lysat témoin pCPD-64 p8oxoGpAlkB pCisPpAbaSpGlycol • Léger effet de la concentration sur le niveau relatif d’ER du lysat nucléaire XPC pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  43. Résultats: Effet de la concentration protéique CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin • Niveau basal + beaucoup de protéines • Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG • Peu d’effet de la concentration sur le profil relatif de XPC • Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA • Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  44. Résultats DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1) • Nos tests in vitro d’excision-resynthèse et d’excision permettent d’appréhender la réparation de l’ADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe • Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo? • Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de la littérature obtenus avec d’autres méthodes de mesure in vivo(Athas et al., 1991; Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993) • Les ratiosProtéines / ADNouProtéines / Lésionssont des paramètres à prendre en considération lors des tests in vitro Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  45. Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal? 1. Niveau basal + concentration protéique standard Discrimination difficile Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction d’ER 2. Irradiation UVB 3. Augmentation de la concentration protéique Discrimination possible Résultats DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2) ? Stimulation de la réparation en réponse aux UVB Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  46. PLAN • Introduction • La réparation de l’ADN • Le Xeroderma pigmentosum • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN • Objectifs • Matériels et Méthodes • Préparation des lysats cellulaires • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo • Résultats • Le niveau basal de réparation • Réponse à une irradiation UVB • Effet de la concentration protéique sur le phénotype d’ER • Conclusions et perspectives Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  47. Informations complémentaires Conclusions et perspectives BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  48. DIAGNOSTIC ? Niveau basal avec concentration protéique standard: faible discrimination des phénotypes XP Irradiation des cellules au préalable Augmentation de la concentration protéique Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC Conclusions et perspectives APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1) • Approfondir l’étude à tous les groupes de complémentation, de A à G • Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de l’ADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  49. Conclusions et perspectives APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2) • Tester des petites molécules: M1 [M1]= 0,1 mM [Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL M1 0 mM • Profil de XPC très différent de XPA • En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

  50. Conclusions et perspectives PERSPECTIVES • Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées • Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs des 6-4 PPs) • Comprendre la signification du niveau basal • Approfondir l’effet de la concentration sur les activités de réparation (lysats totaux, autres groupes de complémentation) • Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse: Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients • Echantillon: arriver à travailler à partir d’un prélèvement sanguin? Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009

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