LE SEQUENCAGE

1. LE SEQUENCAGE

9. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP) - Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …) - Traitement à l’ExoSAP Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP) - Plasmide : Purification - Kit de purification - Quantification - Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille - Nanodrop

10. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  REACTION DE SEQUENCE - Instructions du fournisseur - Quantité d’ADN - Volume du mélange réactionnel - Quantité d’amorce - Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x Volume total = 25 µl ADN (PCR) = 5 ng Amorce = 3 pmoles Tampon 5X = 2,5 µl Kit Big Dye = 1 µl H2O = qsp 25 µl • Kit Big Dye contient : • ADN Polymérase • Tampon • MgCl2 • dNTP • ddNTP*

11. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur - Précipitation éthanolique NaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95% Lavage EtOH 70% - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

12. - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

13. SEQUENCEUR CAPILLAIRE

18. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

19. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

20. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

21. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

22. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

23. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

24. POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ? • A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante • et en déduire la séquence protéique • Trouver des homologies : • Au niveau des gènes d’une même famille • Au niveau d’un même gène dans différentes espèces • Trouver des différences : • Polymorphismes • Mutations •  Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)

25. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

26. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

27. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

28. EXON 9 Homozygote A/A Hétérozygote A/G Homozygote G/G

30. Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié (onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité) 16 et 17/02/2005 : 190_1L

31. Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantes Même tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié 16 et 17/02/2005 : 190_1L

32. Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R

33. Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R

34. Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR : superposition des séquences sens et antisens.

35. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS • Mutation Faux-Sens  Modifie l’acide aminé • - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé • - Vérifier si la classe de l’acide aminé change • Mutation Non Sens  L’acide aminé est remplacé par un Stop • - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée • Mutation d’épissage • - Au niveau du site donneur • - Au niveau du site accepteur • - Insertion/Délétion  Décalage du cadre de lecture • - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée • Mutation silencieuse  Ne modifie pas l’acide aminé • - Mutation intronique

36. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Faux-Sens ATA  GTA (IleVal) c.1336A>G p.I446V

37. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Non Sens CGA  TGA (Arg  Stop) c.2587C>T p.R863X Production d’une protéine tronquée

38. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Délétion/Insertion Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT Séquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23

39. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation d’épissage Intron 12 - c.1828+2T>G

40. EXON INTRON %A 30 40 64 9 0 0 62 68 9 17 39 24 %T 20 7 13 12 0 100 6 12 5 63 22 26 %C 30 43 12 6 0 0 2 9 2 12 21 29 %G 19 9 12 73 100 0 29 12 84 9 18 20 A G GT A A G T SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE

41. http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html

44. CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE GT GT AG AG GT GT AG AG Exon 9 Exon 9 Exon 10 Exon 10 Exon 11 Exon 11 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 9 Exon 10 Exon 11

45. LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR - Mise en évidence de mutations A  G Modification du site accepteur d’épissage

46. INTRON EXON %A 15 10 10 15 6 15 11 19 12 3 10 25 4 100 0 22 17 %T 51 44 50 53 60 49 49 45 45 57 58 29 31 0 0 8 37 %C 19 25 31 21 24 30 33 28 36 36 28 22 65 0 0 18 22 %G 15 21 10 10 10 6 7 9 7 7 5 24 1 0 100 52 25 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y AG G Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base) SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE

49. CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE GT AG GT AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 11 Exon 9 Exon 10 GT GT AG AG AG Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 9 Exon 10 Exon 11 AG

50. LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation silencieuse Homozygote G/G Hétérozygote G/A Homozygote A/A Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr