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21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr

Schülerkongress GBM-Tagung in Münster. 21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr. Tagesablauf. 1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min 2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min 3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung

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21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr

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Presentation Transcript

  1. Schülerkongress GBM-Tagung in Münster 21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr

  2. Tagesablauf 1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min 2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min 3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung 4. Vorbereitung der Proben für die 8. Vorstellung weiterer Ergebnisse Gelelektrophorese 20 min

  3. Pipettenbedienung

  4. Gelvorbereitung

  5. Schneiden des Plasmids pUCD-lacZ mit BanII

  6. Elektrophoretische Trennung der geschnittenen DNA

  7. Escherichia coli • Bewegliches Stäbchenbakterium • Natürliches Habit: • Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm) • Wasserindikator für fäkale • Verunreinigungen • Haustier der Wissenschaft • Verwendeter Stamm in Experimenten: • Sicherheitsstamm K12 (JM109) • Außerhalb Labor nicht lebensfähig • (bestimmte Eigenschaften fehlen) • Kein genetisch veränderter Mikroorganismus (natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)

  8. Weitere Bakterien Desulfovibrio sp. Vibrio cholerae Leptospira ssp. Salmonella enteriditis

  9. Was ist DNA/DNS? DesoxyriboNucleinSäure Helikaler Doppelstrang 4 Basen Adenin, Thymin Guanin, Cytosin Gene: informationstragende Abschnitte für Proteinbiosynthese 1 Codon aus 3 Nukleotiden entspricht 1 Aminosäure

  10. Proteinbiosynthese:Vom Gen zum Protein

  11. Was sind Restriktionsenyzme? Proteine (Eiweiße) Schneiden DNA an spezifischen Erkennungssequenzen (oft Palindrome)

  12. Was sind Plasmide? Neben chromosomaler DNA oft zirkuläre DNA-Fragmente in Bakterien Sicherheitsplasmide: Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZ Ampr: Ampicillinresistenz-Gen Ori: Replikationsursprung

  13. Historie 1865 Mendel 1869 Miescher 1944 Entdeckung der DNA als Trägersubstanz des Erbguts (Avery) 1953 Entdeckung der doppelhelikalen Struktur der DNA (Watson und Crick) 1973 1. rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und Chang 1977 Gentransfer eines humanen Gens auf ein Bakterium (Insulingen) 1982 Insulin als 1. gentechnisches Produkt auf Markt 1983 1. Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine Pflanze (Tabak) 1985 PCR (Mullis) 1988 Gründung von HUGO (Human Genome Project) 2000 Entschlüssung des humanen Genoms von Craig Venter

  14. Bedeutsamkeit • Rekombinante Proteine in therapeutischen und diagnostischen Anwendungsgebieten: • - RecHormon (Erythropoietin=blutbildendes Hormon) • - Reteplase (tPA=Plasminogen Aktivator ) • - Insulin • - Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring) • - Teststreifen für Urin

  15. Analyse von DNA • Agarosegel (molekularer Sieb): • kleinere Fragmente wandern schneller als größere Fragmente durch das Agarosesieb. • Negative Ladung => Wanderung im Spannungsfeld zur Anode (pos. Pol) • Wanderungsgeschwindigkeit linearer doppelsträngiger DNA- Moleküle umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Größe

  16. Auswertung • Vergleich mit bekanntem Bandenmuster • DNA- Fragmente (DNA-Molekulargewichtsstandard) • BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp) • 3 Fragmente erwartet • Berechnung der Größe anhand Plasmidkarte • 2504 bp, 2116 bp, 1049 bp

  17. erwartete Ergebnisse 21226 5480+4732+4268 3530 2027+1904 1584 1375 947 831 564

  18. Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil) • Klonierung eines DNA-Fragments (= Einschleusung eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1 Klon entsteht: • 1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment, Ligation • 2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur 1 von 10 000 nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen defekt ist • 3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin (Plasmid enthalten) und über X-Gal (Spaltung zu blauem Farbstoff, Gen erfolgreich eingeschleust)

  19. Klonierung vonDNA-Fragmenten

  20. Tipps und Tricks zur Versuchsplanung • Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten: • Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 °C • mehrere Wochen bei – 20 °C • 1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT • Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie • ca. 1 Woche im Kühlschrank • Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer • mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage • Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt • mehrere Wochen bei – 20 °C • Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3 Tage • Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt • mehrere Woche bei RT • Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)

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