Obecná genetika nádoru, strategie léčby a farmakogenetika Mgr. Spiros Tavandzis

1. Obecná genetika nádoru, strategie léčby a farmakogenetika Mgr. SpirosTavandzis Laboratoř klinické genetiky, P&R Lab a.s. Onkologické centrum J. G. Mendela Nový Jičín

2. Klonální povaha nádoru • Vzniká vícečetnými genetickými změnami • Všechny buňky nádoru pochází původně z jediné mutované buňky = KLON • primární příčina vzniku nádoru = MUTACE • Faktory ovlivňující vznik nádoru: • genetické faktory + vliv prostředí • epigenetické změny: metylace, microRNA

3. Základní dělení nádorů Některé benigní nádory mohou být nebezpečné např. v CNS – utlačují nervovou tkáň

4. Maligní nádory podle původu • Karcinomy – epiteliální tkáň (90% nádorů) • Sarkomy – mezenchymální tkáň • Lymfomy – lymfatická tkáň • Leukemie – hematopoetická tkáň

5. Rozdělení nádorů z genetického hlediska ZÍSKANÁ vs. DĚDĚNÁ ZMĚNA Převážná většina nádorů vzniká spontánně aktivací určitých genů nebo jejich vyřazením z funkce = kancerogeneze

6. Úrovně ochrany organismu před látkami přijímanými z prostředí (xenobiotiky) • Organismální (vylučování, pocení) • Tkáňová (chemická modifikace xenobiotik v játrech) • Buněčná (aktivita imunitních buněk, tvorba protilátek, apoptóza poškozené buňky) • Molekulárně genetická (reparace poškození DNA) v těle vzniká v průběhu života cca 30-50 mutací/dipl. genom/generaci. Příjem xenobiotik: potrava, tekutiny, vzduch = část negenetické složky variability

7. Proces kancerogeneze • endokrinní faktory • zánět • výživa NEGENOTOXICKÉ kancerogeny GENOTOXICKÉ kancerogeny PRENEOPLASTICKÁ LÉZE INICIACE PROMOCE Genetické změny Reparace DNA Buněčné dělení Buněčné dělení Normální buňka Buňka s adukty Iniciovaná buňka Detoxikační Systémy buňky Další genetické změny Buněčné dělení PROGRESE Apoptóza Buněčná toxicita MALIGNÍ NÁDOR

8. Proces kancerogeneze • Iniciace (mutace, onkogenní viry) - trvalá změna v DNA • Promoce – růstová výhoda • Progrese - zisk dalších výhod (neomezený růst, únik apoptóze, neoangiogeneze, nezávislost na podnětech) • Metastáze – extracelulární matrix, migrace, PRO MALIGNÍ TRANSORMACI BUŇKY JE NUTNÝCH 6 – 7 GENETICKÝCH ZMĚN

9. Vznik nádoru je boj mezi obrannými mechanizmy organizmu a nově získanými vlastnostmi nádorové buňky Základní úkol zdravé buňky je udržet svou genetickou informaci bez poškození

10. Zisk nových vlastností • Neomezený růst (vysoká aktivita telomerázy) • Angiogeneze (zvýšená exprese VEGF) • Nezávislost na růstových signálech (autokrinní stimul) • Nereaguje na sebevražedné signály • Schopnost invaze (aktivní metaloproteázy, kolagenázy) • Schopnost průniku do krve nebo lymfy (poškození mezibuněčné adheze Tyto vlastnosti jsou v zájmu farmaceutických firem

11. Maligní transformace buňkyDobré, špatné, ještě horší… • DOBRÉ – jsme schopni se bránit • Reparace (mutátorové geny) • Detoxikační systémy • ŠPATNÉ – poškození reparace = zvýšení mutační rychlosti až 1000x - poškození genů detoxikačního systému POŠKOZENÍ INTEGRITY GENOMU • JEŠTĚ HORŠÍ – ztráta nádorového supresoru nebo aktivace protoonkogenu • NEJHORŠÍ – kombinace a kumulace změn

12. Molekulární podstata kancerogeneze AKTIVACE PROTOONKOGENU • Funkce protoonkogenů: regulace b. dělení, přenos signálu • Mutace protoonkogenů v somatických buňkách = nedědí se • Účinek mutace na fenotyp: autozomálně dominantní • Protoonkogen→onkogen→onkoprotein (cíl terapie) Způsoby aktivace: • Mutace: c-K-ras ztráta GTPázové aktivity – trvale aktivní • Amplifikace: c-Myc • Translokace: fůze bcr-abl • Inzerční mutageneze: transdukce retrovirů aktivace

13. Molekulární podstata kancerogeneze produkty ONKOGENŮ • Transkripční faktory: MYC, FOS, JUN • Nereceptorovéproteinkinázy: • G-proteiny: RAS • Růstové faktory: EGF • Receptory růstových faktorů: EGFR • microRNA inhibující nádorové supresory Potenciální terapeutické cíle

14. Molekulární podstata kancerogeneze NÁDOROVÉ SUPRESORY • Funkce nádorových supresorů: potlačení proliferace buněk • Mutace v zárodečnýchbuňkách = dědičná predispozice (AD) • Účinek mutace na fenotyp: autozomálně recesivní ztrátou heterozygozyty (mutace, delece, nondisjunkce atd.) • Rb - retinoblastom • APC – familiální adenomatózní polypóza • TP53 - Li-Fraumeniho syndrom (mutován u 50% nádorů) • BRCA1/2 - karcinom prsu / vaječníků • MSH2, MLH1 – kolorektální karcinom Reparační geny

15. Léčba nádoru • Chemoterapie: • DNA poškozující (deriváty cis Pt) • mitotické jedy (vinblastin apod.) – zástava replikace • Radioterapie – zlomy v DNA • Hormonální terapie (Tamoxifen) • Biologická léčba: • Antiangiogenní • Diferenciační • Inhibitory proteazomu • Inhibitory tyrosinkináz • Léčba monoklonálními protilátkam

16. Biologická léčba nádoru • Antiangiogenní • Diferenciační • Inhibitory proteazomu • Inhibitory tyrosinkináz • Léčba monoklonálními protilátkami

17. Cílové struktury léčiv • Složky signálních drah (fůzní produkt bcr-abl – Glivec , CML) • Receptory (EGFR, HER2/neu, ca prsu) • proteazómy • Při léčbě sledovány také jiné markery • Predikce • Prognóza • Ultrastaging • Sledování (MRN)

18. Cílové struktury léčivSložky signálních drah • Produkt fůzního genu bcr-abl: vznik translokaci t(9;22), chybí kinázová reg. doména → trvalá aktivita kinázy abl • Detekce fůzního produktu PCR • CML -> lék Glivec = kompetitor původního substrátu Fůzní produkty: Major – CML a 30-50% ALL Minor - ALL

19. Cílové struktury léčivReceptory (HER2/neu,c-erbB2) • Amplifikace u 15-25% invazivních ca prsu: lék Herceptin (Trastuzumab) • Popis léku • Použití • Účinek • Vznik rezistence k němu

20. Cílové struktury léčivReceptory

21. Detoxikační systém buňky - systém gp-P • Gp-P protein kódován genem MDR1 (multidrug-resistance) • Rodina ABC transporterů (ATP bingingcassette), 7 podrodin • Široká substrátová specifita • Funkce: transport xenobiotik přes intra- a extracelulární membrány (ATP-dependentní „odtoková“ pumpa xenobiotik) • Lokalizace: játra, ledviny, střeva • Způsobuje rezistenci vůči široké škále lékům, včetně protinádorových.

22. Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450 • První fáze detoxikace - transformační: zvyšování polarity xenobiotik (např. vazbou -OH skupin) Účast také na přeměně promutagenů na genotoxické kancerogeny (epoxidy ap.) • Monooxygenázy závislé na cytochromu P450: • Flavinové oxygenázy (odstraňují sloučeniny obsahující N,S,P) • Reduktázy • ADH, SOD, glutathionperoxidázy, katalázy • Druhá fáze detoxikace - konjugační: konjugace s produkty buňky a vyloučení • GST -> vysoká hladina v nádorech, braní léčbě • Metyltransferázy- př. TPMT (thiopurin-S-methyltransferáza) • UDP-glukuronozyltransferázy - > glukuronidace (játra, ledviny)

23. Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450 • Aktivita enzymů (odezva na léčbu) je ovlivněna: • faktory prostředí (podávání enzymových inhibitorů, strava, hormony apod.) • mutacemi v důležitých oblastech genů, které je kódují • pomalí metabolizátoři – mutace na obou alelách = kompletní deficit daného enzymu = kumulace léčiv (TOXICITA) • středně rychlí metabolizátoři– mutace na jedné alele – dostačuje běžná dávka • rychlí metabolizátoři - bez mutace = nedostatečná hladina léku (běžná dávka neúčinná)

24. Zpracování xenobiotik systémem cytochromu P450 Monooxygenázy závislé na cytochromu p450: nadrodina CYP • 18 rodin • podrodiny A-Q • Široká substrátová specifita (psychofarmaka,chemoterapeutika, imunosupresiva atd.) • inducibilita

25. Nežádoucí účinky léků jsou 4. až 6. nejčastější příčinou úmrtí v USA.

26. Důvody rozdílné odezvy na léčbu Individualita každého organismu: Stejný lék -> různí lidé -> různá odezva (rezistence , toxicita, normální metabolizace) (interakce genotyp <-> prostředí) • Rychlejší odstraňování léku z buněk (větší počet ABC transportérů) • Snížená / zvýšená aktivita enzymu detoxikačního systému (mutace enzymů detoxikační kaskády) • V buňkách mohou chybět nebo mohou být změněny cílové proteiny pro použitý lék (mutace, změna exprese) • Vliv prostředí (hormony, strava, léky apod.) NUTNÁ ÚPRAVA DÁVKY NEBO ZMĚNA LÉKU

27. Farmakogenetika(-omika) Zkoumá účinnost léčby v závislosti na genotypu jedince. Důvodem rozdílné odezvy na léčbu je variabilita na úrovni DNA(polymorfismy, delece, inzerce) Farmakogenetika (-omika) poskytuje odpovědi na otázky: • Jak léčit? - správný výběr léku (lék na míru) • Koho léčit? - výběr pacientů podle profitu z léčby PREDIKCE a PROGNÓZA

28. Farmakogenetika nebo farmakogenomika? • Farmakogenetika: analýza jednoho nebo několika polymorfismů u známých genů asociovaných s metabolizaci určitého léku. • DNA úroveň – vliv mutace na aktivitu enzymu • Farmakogenomika: analýza expresního profilu velkého počtu nespecifikovaných genů (desítky až tisíce genů) u vybrané skupiny pacientů. • RNA úroveň - porovnáváním expresních profilů lze : • vytipovat nebo sledovat expresi skupin genů asociovaných s odpovědi na léčbu (neúčinnost léčby, toxicita). • zjistit skupiny pacientů s příznivou x nepříznivou prognózou

29. Metody farmakogenetiky PCR – sledování patogenních mutací ve vybraných genech Q-RT-PCR - sledování úrovně exprese několika genů Microarrays– souběžná analýza velkého počtu genů (řádově až tisíce) – vyhledávání odlišností v expresním profilu

30. Prognóza onemocnění a predikce léčby • Prognóza: dle výsledku stagingu a gradingu • nutné průběžně monitorovat účinek zvoleného léku. • Včasný záchyt mikrometastáz (sledování MRN)

31. Prognóza Klinický a histopatologický odhad rizika je založen na sledování nepřímých parametrů: • Věk • Velikost nádoru • Postižení lymf uzlin • Histologický grade atd. Tyto směrnice mohou vést ke zbytečné léčbě mnoha pacientů! Způsob léčby dle doporučení směrnic EU a US

32. Prognóza a monitoring léčby Standardně používané metody • Histologie a IHC: PCAN, Ki67 prolif. aktivita, onkoproteiny, receptory HER2, ER • Fyzikální metody (MRI, CT apod.) • Biochemické a sérologické metody (ELISA) • Cytogenetika

33. Prognóza a monitoring léčby Molekulárně biologické a genomické metody • Imunomagnetická selekce nádorových buněk Krev • Ultrastaging - exprese vybraných genů asociovaných s nádorem • Q-realtime RT-PCR • Lowdensityarrays • Microarrays Primární nádor