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DNA-Klonierungsvektoren

DNA-Klonierungsvektoren. Replikationsorigin: ColE1 in pUC-Derivaten (Plasmid-Kopiezahl) Resistenzgen: Amp, Kan Multi-Cloning-Site: Restriktionsschnittorte Sequenzierungsprimerbindungssites. E. coli -Expressionsvektoren.

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DNA-Klonierungsvektoren

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Presentation Transcript

  1. DNA-Klonierungsvektoren Replikationsorigin: ColE1 in pUC-Derivaten (Plasmid-Kopiezahl) Resistenzgen: Amp, Kan Multi-Cloning-Site: Restriktionsschnittorte Sequenzierungsprimerbindungssites

  2. E. coli-Expressionsvektoren Promotor: z. B. tac, T7, lac (strenge Regulation und Stärke der Genexpression) Ribosomenbindungssite Startkodon: ATG (Aminosäure Methionin) Gen* Terminator *Codon-Usage: (verschiedene Organismen nutzen verschiedene Triplett-Codes) bestimmte tRNA‘s stehen oft in heterologen Organismen nicht zur Verfügung Mutagenese des Gens hinsichtlich der Kodons Stämme, die seltene Codon tRNA Gene exprimieren sonst Stopp der Translation, verkürzte Proteine

  3. Optimierung der Proteinexpression in E. coli Expressionssystem abhängig von Proteinstruktur: 1. cytoplasmatisches Protein 2. sekretorisches Protein 3. disulphidverbrücktes Protein zu 2./3. :Sekretion der Proteine ins Periplasma (oxidatives Milieu, Bildung von Disulphid-Brücken) Nutzung von Signalpeptiden: pelB Signalpeptidase ist in E. coli vorhanden

  4. Optimierung der Expression - Kultivierungstemperatur - Stärke der Induktion - Niedermolekulare Medienzusätze Durchlässigkeit der Membran von unter 600 Da-Stoffe (GSH-GSSG, künstliches Oxidatonssystem, L-Arginin, Sorbitol, Glycin Co-Expression von Chaparonen) - Faltungshelfer, Verhinderung der Aggregation Assemblierung mit der sich bildenden Proteinkette Haltung der Kette im entfalteten Zustand) von Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerasen von Proteindisulfid-Isomerasen - E. coli-Stämme: verminderte Proteaseaktivität

  5. Wirtsorganismen zur heterologen Proteinexpression Prokarytisch E. coli Bacillus subtilis Eukaryotisch Hefe Insektenzellen (Baculovirussystem) tierische, pflanzliche Zellkultur transgene Tiere transgene Pflanzen

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