STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI IN LABORATORIO.

1. A.Caria, M.Cabiddu, I.Ibba, C.Cicalò STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI IN LABORATORIO. DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M1 NEL LATTE CON METODICA HPLC DOPO PURIFICAZIONE CON COLONNE DI IMMUNOAFFINITA’ 6° MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DI LABORATORIO DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

2. OBIETTIVO DEL METODO Determinare la quantità di aflatossina M1 nel latte impiegando un procedimento di estrazione con colonna di immunoaffinità e misurazione con HPLC con rivelatore a fluorescenza MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

3. UNI CEI ENV 13005:2000 § 3.4 CONSIDERAZIONI PRATICHE 3.4.8”……l’incertezza non può sostituirsi al pensiero critico, all’onestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dell’incertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramente matematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e della misurazione. La qualità e l’utilità dell’incertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto, in definitiva dall’approfondimento, dall’analisicritica e dall’integrità morale di chi contribuisce ad assegnare il valore “. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

4. IL PROCEDIMENTO PER LA STIMA DELL’INCERTEZZA 1. SPECIFICAREILMISURANDO INIZIO 2. IDENTIFICARELEFONTI DINCERTEZZA 3. SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI 4. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE 5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RESIDUE 6. CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO 7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA E L’INCERTEZZA ESTESA FINE MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

5. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005 FASE 1. SPECIFICARE IL MISURANDO SGRASSATURA ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE ELUIZIONE PREPARAZIONE DEL MATERIALE PER LA TARATURA CONCENTR.ESTRATTO E DILUIZ.A VOLUME MISURAZIONE CONHPLC TARATURAHPLC RISULTATO

6. IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO FASE 2- IDENTIFICARELEFONTI DI INCERTEZZA • Il diagramma causa-effetto è un modo utile per elencare le fonti di incertezza. • Mostra le loro reciproche relazioni e indica l’influenza del risultato • Serve a evitare di contare alcune fonti più di una volta MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

7. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005 FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO COME SI COSTRUISCE 1. SCRIVERE L’EQUAZIONE COMPLETA PER IL RISULTATO. I PARAMETRI DELL’EQUAZIONE COSTITUISCONO I RAMI PRINCIPALI DEL DIAGRAMMA. SE APPROPRIATO AGGIUNGERE RAMI CHE RAPPRESENTANO LO SCOSTAMENTO GLOBALE( AD ES. RECUPERO ) • CONSIDERARE OGNI FASE DEL METODO E AGGIUNGERE I RELATIVI FATTORI AL DIAGRAMMA A PARTIRE DAGLI EFFETTI PRINCIPALI • PER OGNI RAMO AGGIUNGERE I FATTORI CHE CONTRIBUISCONO FINCHE’ GLI EFFETTI DIVENTANO TRASCURABILI • 4. RIDISEGNARE IL DIAGRAMMA RISOLVENDO LE DUPLICAZIONI, RENDENDO ESPLICITI I CONTRIBUTI E ACCORPANDO LE CAUSE COLLEGATE. METTERE I TERMINI RELATIVI ALLA PRECISIONE IN UN RAMO SEPARATO

8. FASE 2- IDENTIFICARELESORGENTI DI INCERTEZZA EQUAZIONE DI BASE UTILIZZATA PER IL CALCOLO DEL MISURANDO • Tutti i parametri dell’equazione possono avere un’incertezza associata con il loro valore e quindi sono potenziali fonti di incertezza. • Ci possono essere anche altri parametri che pur non comparendo nell’equazione influenzano i risultati ( es tempo di estrazione e temperatura ) e quindi sono fonti potenziali di incertezza. • La nostra equazione è: Wm = [mA ( Vf / Vi ) . 1/V] dove Wm= misurando mA= quantità di aflatossina M1 in ng corrispondente all’area del picco di aflatossina M1 del campione Vi = volume di campione iniettato in µl Vf= volume di ripresa del campione in µl V = quantità del campione iniziale in ml MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

9. FASE 2. IDENTIFICARELE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO VOLUME INIEZIONE AREA PICCO CAMPIONE VOLUME FINALE RISULTATO MATERIALE RIFERIMENTO RECUPERO VOLUME INIZIALE CAMPIONE MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

10. FASE 2-IDENTIFICARELE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO AREA DEL PICCO CAMPIONE mA MAT.RIFER. VOLUME FINALE Vf Operatore Ripetibilità Inc. mr Temperatura Diluizione Diluizione Taratura Taratura vetr. Precisione Ripetib. Ripetib. Ripetib. Ripetib. Op. Op. Op. Op. QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE Tar.vetr Tar.vetr Tar.vetr Tar.vetr Operatore Precisione Precisione Temperatura Taratura HPLC Tarat vetreria Operatore VOLUME INIZ CAMP V VOL.INIEZ. RECUPERO R AREA PICCO MR MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

11. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005 FASE 2. IDENTIFICARELE SORGENTI DI INCERTEZZA PROCESSO ANALITICO FONTI DI INCERTEZZA FONTI DI INCERTEZZA -CAPACITÀ OPERATORE SGRASSATURA -CAPACITÀ OPERATORE - QUALITA’ DELLA COLONNINA ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE • -QUALITA’ VETRERIA • -CAPACITÀ OPERATORE • QUALITA’ REAGENTE ELUIZIONE CON ACETONITRILE - MATER.RIFERIM - CAPACITA’ OPERAT. - TARATURA PIPETTE - QUALITA’ VETR. - TEMPERATURA -CAPACITA’ OPERATORE - QUALITA’ DELLA VETRERIA CONC.ESTRATTO E DILUIZ.A VOL. PREPARAZIONE DEL MATERIALE PER LA TARATURA • -CAPACITÀ OPERATORE • -INTEGRAZIONE • -VOLUME INIEZIONE • -CALCOLO RISULTATO • -TARATURA • -QUALITA’ DEI REAGENTI MISURAZIONE CONHPLC TARATURAHPLC CAPACITA’ OPERAT. RISULTATO

12. FASE 3 : SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO RIPETIBILITA’ AREA PICCO CAMP mAMAT.RIF. VOLUME FINALE Vol iniezione Volume e dil mr Taratura Temper Temper Area picco mr Taratura HPLC Area picco campione Vol fin estratto diluizione mr Vol iniz camp Tarat vetreria QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE Inc. mr Temper. Taratura HPLC Tarat vetreria VOL. INIEZ RECUPERO R AREA PICCO MR VOLUME INIZ CAMP MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

13. FASE 4-5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO RIPETIBILITA’ (1) AREA PICCO CAMP mA (1)MAT.RIF.(3) VOLUME FINALE (1) Vol iniezione Volume e dil mr Taratura (2) Temper Temper Area picco mr Taratura HPLC (3) Area picco campione Vol fin estratto diluizione mr (1) Vol iniz camp Tarat vetreria (2) QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE Inc. mr (3) Temper. Taratura HPLC (3) Tarat vetreria (2) VOL. INIEZ RECUPERO R (2) AREA PICCO MR (1) VOLUME INIZ CAMP (1) • Ripetibilità considerata durante lo studio di variabilità del procedimento analitico • Considerata durante lo studio dello scostamento sistematico • Da considerare durante la valutazione delle altre fonti di incertezza MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

14. Fasi 4 E 5 QUANTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DELL’INCERTEZZA • La miglior stima disponibile della variazione globale tra le diverse esecuzioni del processo analitico ( ripetibilità ) • La miglior stima disponibile dello scostamento sistematico globale (recupero ) e della sua incertezza • La quantificazione di qualsiasi incertezza associata con effetti di cui non si sia tenuto conto in modo completo negli studi delle prestazioni globali MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

15. FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPOSTUDIO DI VARIABILITÀ DEL PROCEDIMENTO ANALITICO RIPETIBILITA’ MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

16. FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO STUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO E’ stato eseguito durante la validazione del metodo mediante prove di recupero ( campioni omogeneizzati divisi in due aliquote, una delle quali addizionata con aflatossina M1 ) L’incertezza tipo è stata calcolata come scarto tipo della media u (REC)= SCARTO TIPO % DEL RECUPERO √NUMERO ESPERIMENTI CONDOTTI Valutazione del recupero: verificare se è significativamente uguale a 1 ( 100% ) ; usando un test di significatività( t-test ) t= 1-REC /u (REC) MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

17. FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPOSTUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

18. FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO ALTRE FONTI DI INCERTEZZA Incertezza del materiale di riferimento fornita dal produttore u = 0.0068 già trasformata in distribuzione rettangolare dividendo per √3 MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

19. FASE 7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA INCERTEZZA TIPO RELATIVA DEL CAMPIONE = radice della somma delle incertezze di ripetibilità, del recupero e del materiale di riferimento uc ( Wm )/ Wm =√ somma delle incertezze tipo relative uc (Wm) = √(0.0945)2+ (0.01657)2+ (0,0068)2 Wm uc (Wm) = Wm√(0.0945)2+ (0.01657)2+(0.0068)2 Wm = 34.60 uc =3,33 MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

20. ESPRESSIONE DEL RISULTATO CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA Calcolo dei gradi di libertà effettivi: = 13 Formula di Welch Satterthwaite Il numero dei gradi di libertà effettivi risulta maggiore di 10 pertanto il fattore di copertura può essere assunto uguale a 2 (v. SINAL DT 0002 ). INCERTEZZA ESTESA U (Wm) U (Wm) = [uc (Wm ) ] . 2 MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

21. FINE ESPRESSIONE DEL RISULTATOCALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA U (Wm) = [ uc (Wm ) ] . 2 Wm = 34.60 ng/l ± 6,66 k =2 e t = 95% MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

22. Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo Lo scarto tipo di riproducibilità ottenuto in uno studio collaborativo può essere assunto come l’incertezza del metodo da riportare nel rapporto di prova La riproducibilità del metodo è il parametro completo nella valutazione della precisione; tiene conto di tutte le possibili variabilità all’interno e all’esterno dei laboratori MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

23. Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo SI ATTRIBUISCE ALLA RIPRODUCIBILITA’ IL VALORE DELL’INCERTEZZA COMPOSTA E SUCCESSIVAMENTE, TRAMITE OPPORTUNO FATTORE DI COPERTURA, SI OTTIENE L’INCERTEZZA ESTESA. Wm± k . SR MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

24. RIFERIMENTI • UNI EN ISO/IEC 17025:1999 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura • Istituto Superiore di Sanità- Quantificazione dell’incertezza nelle misure analitiche.Seconda Edizione (2000) della Guida EURACHEM/CITAC CG 4-Rapporti ISTISAN 03/30 • SINAL DT-0002 Guida per la dichiarazione dell'incertezza di misurarev 1 • UNI CEI ENV 13005 – Luglio 2000- Guida all’espressione dell’incertezza di misura • De Martin – ARPA-FVG-RGQ Pordenone: Workshop “ Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova: le linee guida delle Agenzie Ambientali-Ottobre 2003”