Microbiologia Teórica 32

1. MicrobiologiaTeórica 32 2º Ano 2011/2012

2. Sumário • Capítulo XXX. A microbiologia como pilar das ciências biomédicas • Expectativas dos alunos. Análise de resposta à pergunta para que serve a microbiologia em Ciências Biomédicas? • Exemplos das análises clínicas • Exemplos da Indústria Farmacêutica • Controlo de Qualidade • Produção de medicamentos por microrganismos • Exemplos da Indústria Agroalimentar • Investigação em Ciências Biomédicas • Microbiologia e diagnóstico • Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de terapêutica • Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas e terapêuticas T32-34 MJC

3. Microbiologia e análises clínicas • Microbiologia e Parasitologia Médicas • São função exclusiva dos biomédicos nalguns países com UK. • O Cientista Biomédico tem de ser capaz de: • Fazer diagnóstico microbiológico de amostras médicas. • Por cultura • Por coloração • Por testes bioquímicos • Por testes moleculares • Fazer o diagnóstico da imunidade serológica • Análise de anticorpos ou antigénios presentes no soro dos pacientes T32-34 MJC

4. Microbiologia e Indústria Agroalimentar • Controlo de qualidade microbiológicas: • Matérias primas • Processos • Produtos finais • Monitorização de fermentadores ou bioreactores onde existe a produção de alimentos ou aditivos por bactérias: • Produção de proteínas recombinantes ou nativas • Isolamento e purificação desses produtos T32-34 MJC

5. Microbiologia Investigação em Ciências Biomédicas • Microbiologia e diagnóstico • Desenvolvimento e aprefeiçoamento de novas formas de diagnóstico • Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de terapêutica • Utilização dos microrganismos em novas formas de terapêutica ou produção de conhecimento que leve ao desenvolvimento de novas formas terapêuticas • Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas • Associação de agentes microbianos a patologias e/ou caracterização de novoas agentes etiológicos de patologias infecciosas. T32-34 MJC

6. Microbiologia Investigação em Ciências Biomédicas • Técnicas que é necessário o cientista biomédico dominar: • Cultura de células microbianas • Observação ao microscópio de lâminas preparadas e preparação de lâminas para observação ao microscópio. • Identificação de microrganismos pelas várias técnicas • Bioquímicas • Moleculares T32-34 MJC

7. Bibliografia T32-34 MJC

8. MicrobiologiaTeórica 33 2º Ano 2011/2012

9. Sumário • Capítulo XXX. • Exemplos das análises clinicas • Análise de um artigo que faz o teste de um método de diagnóstico microbiológico da doença periodontal • A pergunta • Os métodos utilizados • Os resultados • As conclusões. • Em que passos deverá intervir o Biomédico? T32-34 MJC

10. Diagnóstico Microbiológico da Doença Periodontal • É possível? • É útil? • Está disponível? • Que métodos de investigação? • Que testes? T32-34 MJC

11. Artigo ”Comparison between polymerase chain reaction-based and checkerboard DNA hybridization techniques for microbial assessment of subgingival plaque samples.”

12. Que técnicas existem para detectar/quantificar MO periodontopatogénicos? • Cultura • Teste BANA Benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA) test (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, e Bacteroides forsythus) • Observação directa T32-34 MJC

13. Que técnicas existem para detectar/quantificar MO periodontopatogénicos? • Métodos moleculares • PCR • RT-PCR • DNA-DNA hibridization T32-34 MJC

14. Qual o objectivo da investigação presente? • Compara os resultados obtidos por dois métodos moleculares. • PCR e aplicação dos testes Micro-Ident • Hibridação DNA-DNA (sem PCR) • Para as mesmas amostras de pacientes saudáveis e de pacientes com periodontite. T32-34 MJC

15. Caracterização da população estudada. • Todos com mais de 20 anos • Saudáveis sem ser a periodontite • Sem tratamento periodontal ou antibiótico sistémicos há pelo menos 3 meses • 25 pessoas • Grupo com patologia periodontal • Pelo menos 24 dentes • Sem locais com PD acima de 4 mm • Grupo saudáveis • Com pelo menos 20 dentes • Mais de 5% de dentes com PD acima de 4mm T32-34 MJC

16. Como foi feita a avaliação microbiológica? • Tiradas amostras de 6 locais nos doentes com periodontite: • 2 em bolsas com menos de 4mm • 2 em bolsas com 4-6 mm • 2 em bolsas com mais de 6 mm • Paper points for the Micro ID test • Cureta para DNA-DNA • Nas amostras para o Microident (Fotos slide 2): • Extração de DNA  PCR  hibridização com membrana com 13 sondas específicas. • Verificação do sinal e classificação por comparação com escala em 0,5 ate 3 de abundância • Nas amostras de DNA-DNA hibridization (Fotos slide 6) • Extração de DNA  hibridização com os chips de DNA T32-34 MJC

17. Teste MicroIDent Este é o resultado que o médico dentista recebe como relatório não o resultado laboratórial. No laboratório o resultado é lido por hibridização com uma membrana de nitrocelulose. T32-34 MJC

18. DNA-DNA Checker Board T32-34 MJC

19. Quais os resultados da investigação? T32-34 MJC

20. Quais os resultados da investigação? • Ambos os métodos têm “perfis” diferentes para indivíduos com doença periodontal e sem. • Num há 11 espécies com diferenças significativas estatisticamente entre saúde e doença. • Noutro há 10 espécies estatisticamente diferentes entre saúde e doença. T32-34 MJC

21. Quais os resultados da investigação? T32-34 MJC

22. Quais os resultados da investigação? • Há alguma concordância na especificidade e na sensibilidade dos testes T32-34 MJC

23. Quais os resultados da investigação? T32-34 MJC

24. Quais os resultados da investigação? • Para a maioria das espécies é indiferente usar um ou outro teste que os resultados estatisticamente não diferem mesmo quando se consideram as quantificações. T32-34 MJC

25. Conclusões gerais • Para algumas das espécies os resultados são muito semelhantes. • Para outras há maiores diferenças • O facto de para os agentes mais associados à periodontite os resultados serem muito semelhantes leva a supor que os dois tipos de teste podem ser usados alternativamente. T32-34 MJC

26. MicrobiologiaTeórica 34 2º Ano 2011/2012

27. Sumário • Capítulo XXX. • Exemplos das análises clinicas. • Procedimentos normais num consultório de Análises clínicas • Análise de uma amostra de urina • Análise preliminar • Cultivo • Antibiograma • Análise serológica de marcadores da hepatite • Testes serológicos T32-34 MJC

28. Num laboratório de análises clínicas... • Cultivo de bactérias e fungos em placas • Exame directo de amostas de esfregações, urina ou fezes. • Preparação, fixação, coloração e exame de lâminas de sputum, esfregações, fezes, fluído encefalo raquidiano e organismos de cultura. As colorações incluem coloração de gram mas também outras colorações específicas para algumas amostras. • Inoculação e leitura de testes bioquímicos para identificação de Microrganismos • Determinação de sensibilidade a antibióticos por antibiogramas. • Testes serológios para fetecção de antigénios ou anticorpos. T32-34 MJC

29. Análise microbiológica de uma amostra de urina • Análise preliminar: • Tiras de detecção de: • Leucócitos • Proteínas • Glicémia • Permitem a despistagem rápida de infecção urinária. http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/near-patient-testing/combur/ T32-34 MJC

30. Análise microbiológica de uma amostra de urina • Análise cultural: • Análise de crescimento, quantificação. • Esta é feita pois a inoculação é feita usando um volume determinado de urina 0.01 ou 0.001ml. • A cultura é feita em agar de sangue, MacConkey ou Colistin-nalidixic ácid Agar (CNA). • Antibiograma • Em meio Mueller-Hinton é feita a cultura dos isolados onde são testados alguns antibióticos passíveis de ser utilizados. http://www.youtube.com/watch?v=FOimwWEV6vU&feature=player_embedded T32-34 MJC

31. Análise serológica de marcadores de HBV • Marcadores: • HBSag (Antigénio de superfícies de vírus da hepatite B) • HB anti-core (anticoprpo para o antigénio core do vírus da hepatite B). • HBeAg (Antigénio e do vírus da hepatite B) • Anti-HBe (anticorpo contra o antigénio e do vírus). T32-34 MJC

32. Procedimento para detecção de antigénios T32-34 MJC

33. Em todos os testes de ELISA há: • Replicados da amostra • Um contolo positivo em que há uma concentração conhecida do antigénio a detectar. • Um contolo negativo em que não há o antigénio a detectar. • A leitura é feita por espectofotometria que mede a intensidade da cor gerada da reação da enzima com o substratos presentes. T32-34 MJC

34. Sumário • Capítulo XXX. • Risco associado ao trabalho em laboratórios de análises clínicas. • Risco biológico • Risco quimico • Risco físico • Risco eléctrico • Risco ambiental T32-34 MJC

35. Risco Biológico • Todas as amostras são potencialmente perigosas! • Usar o equipamento de segurança pessoal adequado: • Luvas • Batas • Óculos quando necessário • Respeitar as normas de segurança dos níveis de risco biológico: • Nível 1 • Nível 2 • Nível 3 • Nível 4 • Todos os níveis pressupõem a adopção das medidas do nível anterior. T32-34 MJC

36. Nível 1 • Nível 1: Bactérias e vírus  Bacillus subtilis, caninehepatitis, Escherichia coli, varicella (chicken pox),e algumas culturas celulares não infecciosas. • Na manipulação deste material pode apenas usar-se luvas. • A descontaminação deste nível é feita por lavagem das mãos e descontaminação por autoclavagem de todo o material contaminado. T32-34 MJC

37. Nível 2 • Bactérias e vírus que causam doenças pouco graves em humanos ou que dificilmente podem ser contraídos por aerossois. • Hepatitis A, B, e C, influenza A, Lyme disease, salmonella, papeira, rubeola, febre de Dengue e HIV. • Têm de ser usadas câmaras de segurança biológica nível 2. • Acesso limitado ao laboratório • Avisos de perigo biológico • Descontaminação de todo o material antes de ser deitado no lixo. T32-34 MJC

38. Nível 3 •  Bactérias e vírus que podem causar patologias fatais em humanos mas para as quais há vacinas e outros tratamentos. • anthrax, West Nile virus,encefalite equina Venezuelana , SARS, variola , tuberculose, tifo, Febre Rift Valley fever, Febre Rocky Mountain spotted fever, Febre amarela e malaria. • Trabalho obrigatório em câmaras de segurança biológica 3 • Acesso controlado ao laboratório • Descontaminação da roupa antes de lavar. • Descontaminação de todo o equipamento T32-34 MJC

39. Nível 4 • Víruses e bactérias que causam patologias severas e fatais em humanos para as quais não há tratamentos nem vacinas disponíveis. • Febres hemorrágicas • Trabalho não autorizado na maior parte dos laboratórios. • Controlo de entrada e saída de todas as pessoas e materiais. T32-34 MJC

40. Risco Químico • Algumas das substâncias usadas para preparar as amostras têm vários riscos associados. • É preciso saber a sinalética e respeitar as normas de segurança de cada substância • Não cheirar • Não pipetar com a boca • Ter cuidados especiais com a chama • Cuidados com o contacto com a pela de substâncias carcinogénicas T32-34 MJC

41. Risco Eléctrico • Além das precauções normais de senso comum ... • Necessário asseurar que os equipamentos são mantidos em condições ao longo dos anos. T32-34 MJC

42. Risco Físico • Cuidado esqpecial com a arrumação do laboratório • Evitar gavetas e portas dos armários abertas • Evitar caixas ou obstáculos no chão que possam promover quedas. • Cuidado com a abertura brusca de portas especialmente as que abrem para os dois lados! T32-34 MJC

43. Risco Ambiental • Cuidados na separação dos lixos • Eliminação responsável de substâncias como mercúrio, chu,bo ou outras susbtâncias químicas nocivas para o ambiente • Manutenção do ar do laboratório com qualidade • Monitorização da qualidade do ar • Manutenção dos filtros e condutas de ar condicionado. T32-34 MJC

44. Recursos • http://www.cdc.gov/niosh/topics/healthcare/#c • Capítulo 5. Secção 5.4 • Capítulo 6. Secção 6.5 T32-34 MJC