Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

1. Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente • Modulo di “Microbiologia applicata all’ambiente”. • Requisiti: buone conoscenze di microbiologia e degli aspetti ambientali della microbiologia (Corso di Biotecnologie Ambientali 3° anno LT)

2. Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente • Struttura del corso: - Breve ripasso/riesame delle tematiche principali della microbiologia ambientale (2-3 lezioni) - Studio delle tematiche di interesse nella ricerca in microbiologia ambientale tramite lettura ed analisi di lavori scientifici (reviews, articoli di ricerca) come discussione interattiva in un Journal Club

3. Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente • Prova d’esame: • 12 punti: presentazione di una tematica a partire da lavori di ricerca • 5 punti: frequenza/partecipazione al corso • 15 punti: prova finale - Discussione “one-to-one” di una tematica presentata negli articoli discussi durante il corso.

4. Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente • Argomenti principali che verranno toccati nel corso: - Processi e microrganismi coinvolti nella degradazione di sostanze inquinanti e tecniche di biorisanamento - Ecologia microbica: metodologie di monitoraggio delle comunità microbiche e loro applicazioni. - Metagenomica: identificazione di nuove specie non coltivabili in laboratorio; applicazioni pratiche. - Utilizzo di microrganismi biosensori.

5. Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente • “Entry test” (ovvero: cosa credete di sapere e cosa realmente sapete.....)

6. Risultati entry test

7. Geni controllati da un promotore di interesse I- Biosensori Situazione fisiologica; ceppo wild type Es. codificanti per geni per la degradazione Biosensore Gene reporter: codifica una proteina la cui attività può essere facilmente saggiata; La fusione promotore::gene reporter (es. xylE::lacZ) può essere costruita inattivando l’operone originale o clonando il promotore a monte di un gene reporter, generalmente su un plasmide Promotore di interesse clonato a monte di un gene reporter Rep. gene

8. Problematiche legate ai microrganismi biosensori • Sensibilità (deve rispondere a concentrazioni nell’ordine dei ppm (= mg/ml) • Specificità: rispondere esclusivamente al prodotto di interesse (in alcuni casi) o al più elevato numero di molecole correlate possibile • Stabilità genetica, riproducibilità, affidabilità.

9. Unità gene reporter (b-galattosidasi) induttore Limitare o aumentare lo spettro di azione di un biosensore? 2-nitrotoluene 4-nitrotoluene

10. Miglioramento genetico di ceppi biosensori

11. Ecologia microbica • I microrganismi sono fondamentali nei cicli geochimici degli elementi (C, N, S, etc.) permettendo di mantenere in omeostasi (equilibrio) le diverse forme chimiche di questi elementi • Lo squilibrio tra popolazioni microbiche diverse porta ad una perturbazione all’interno dei cicli degli elementi (e viceversa).

12. Ciclo dell’Azoto

13. La presenza di cicli geochimici in equilibrio è una delle basi dell’ “ipotesi Gaia” • La terra è un sistema autoregolante capace di mantenere le sue caratteristiche chimico-fisiche (temperatura media, percentuali dei gas, acidità...), in condizioni idonee alla presenza della vita grazie al comportamento degli organismi viventi stessi. (Lovelock and Margulis, 1974)

14. Ecologia microbica e metagenomica • Problema principale: Nella microbiologia “classica”, l’isolamento e la crescita come “coltura pura” sono fondamentali per lo studio e la caratterizzazione di un microrganismo. Nelle comunità microbiche naturali, alcune reazioni metaboliche vengono effettuate da più specie: la crescita in laboratorio porta alla perdita della diversità genetica e, quindi, delle capacità metaboliche di una data comunità. Concetto di microrganismi VBNC: “Viable but not culturable” Lo studio delle metagenomica consente l’identificazione (almeno parziale) di nuove specie batteriche a partire dalle loro sequenze di DNA, SENZA la necessità di isolare e crescere queste specie in laboratorio.

15. Il problema della coltivazione

16. Il problema della valutazione della complessità delle comunità microbiche • Il concetto tassonomico di “specie” è difficilmente applicabile al mondo microbico • La tassonomia molecolare si basa sulla similarità di sequenza tra geni che costituiscono un riferimento significativo per seguire l’evoluzione delle specie (“cronometri evolutivi” es. 16S rRNA, gene rpoB) • La differenza tra OTU (Operational Taxonomic Units) è fissata al 3% di diversità nel gene marker • La conoscenza ed identificazione delle diverse specie è importante per l’attribuzione di funzioni metaboliche e biochimiche ad una comunità microbica

17. Ma la specie non è tutto.... • All’interno di una medesima specie esiste una enorme diversità genetica e metabolica, legata a presenza di elementi di DNA mobile (plasmidi, integroni, etc.) o a semplici mutazioni puntiformi Es: isolati di Escherichia coli in grado di produrre particolari strutture extracellulari

18. Le tecniche molecolari

19. ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA COMUNITA’ MICROBICA ESTRAZIONE DNA DAL CAMPIONE AMBIENTALE AMPLIFICAZIONE PER PCR DI UN FRAMMENTO DEL GENE 16s rRNA ANALISI DIRETTA DELLA DIVERSITA’ DEL CAMPIONE (es. DGGE, T-RFLP)

20. Identificazione molecolare dei componenti di una comunità microbica Primer usati per la PCR: 16S RNA (per Bacteria) rRNAs (universale) Per microrganismi eucarioti: 18S RNA ITS (internal transcribed spacer) DNA ambientale o da coltura Prodotti di PCR da analisi di campioni ambientali analizzati su gel d’agarosio non denaturante Specifiche bande possono essere estratte e sequenziate I frammenti vengono separati in condizioni denaturanti (generalmente gradiente di urea)

21. La DGGE è un importante tool sperimentale Tempo (sett.): 0 4 0 4 Aggiunta benzoato + - Monitoraggio di microrganismi in grado di degradare composti aromatici in un modello sperimentale di crescita in suoli contaminati e non.

22. Analisi T-RFLP (terminal restriction length polymorphism)

23. ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA COMUNITA’ MICROBICA Creazione di una libreria di frammenti del gene 16S rRNA ESTRAZIONE DNA DAL CAMPIONE AMBIENTALE • lunghezza frammento fino a 1500 pb • numero di cloni ottenuti: intorno ai 300-400 AMPLIFICAZIONE PER PCR DI UN FRAMMENTO DEL GENE 16s rRNA ANALISI DIRETTA DELLA DIVERSITA’ DEL CAMPIONE (es. DGGE, T-RFLP)

24. Tre problemi nella definizione dell’ecologia microbica di un determinato (micro)ambiente • Definizione di specie nell’ambito microbico (OTU) • Capacità di “vedere” i microrganismi, ivi inclusi i microrganismi VBNC • Determinare da un punto di vista statistico il numero di specie (OTUs) che ci permette una definizione sufficientemente completa di un ambiente (Schloss and Handelsmann, Ann. Rev. Micro. 2007)

25. Stima della biodiversità (curve di rarefazione) Raccolta dati (screening dei cloni ottenuti) STIMA BIODIVERSITA’ % di differenza nella sequenza del gene marker (es. 16S RNA

26. Perché la definizione precisa della biodiversità è così importante? • Conoscenza “teoretica” delle specie microbiche • Correlare presenza di specie ad attività biologica di interesse (biorisanamento, produzione di molecole di interesse) • Confrontare ambienti simili, ma di diversa provenienza, in termini di composizione microbica, per prevederne le caratteristiche • Problema metodologico: significatività statistica del campione in esame

27. Un problema simile: uso delle parole in libri di un determinato autore (the book model) St: numero totale di singole parole utilizzate Nt: numero totale di parole nel libro

28. Annual Reviews

29. Confronto di comunità microbiche nei suoli dell’Alaska (a-b) e del Minnesota (c-d) Annual Reviews

30. Annual Reviews

31. FIG. 1. Phylogenetic tree of Bacteria showing established phyla (italicized Latin names) and candidate phyla described previously (70, 74, 114) with the November 2003 ARB database (http://arb-home.de) (90) with 16,964 sequences that are >1,000 bp Nitrospira: nuovo genere di batteri nitrificanti (ossidazione di nitrito a nitrato) Handelsman, J.. 2004. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(4):669-685