Expressão Gênica

1. Expressão Gênica Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN

2. Expressão Gênica • Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico • Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (=transcrição & tradução) • A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas)

3. Expressão Gênica • ... então os genes interagem em redes complexas: • Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta (upregulates) A, ... • Assim, perturbações em um único gene podem levar a mudanças na expressão de vários genes

4. Para que estudar Expressão Gênica ? • As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada • A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar uma doença

5. Genômica Funcional • O próximo passo após o sequenciamento: • Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e características fenotípicas do organismo • Passo complexo • Proteínas e genes interagem em redes altamente conectadas • Tradicionalmente a biologia molecular vem trabalhando baseada no paradigma • Um gene, uma função • No entanto,...

6. Microarrays • ... microarray podem medir a expressão de vários genes ao mesmo tempo • Microarrays são em geral lâminas de vidro com uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas • Um spot contém milhões de moléculas de DNA idênticas ou oligonucleotídeos (sondas) • As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais como cDNA de um gene • O microarray pode conter milhares de spots • Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano

7. Experimentos com Microarrays traduzido proteína • Quase todo mRNA • mRNA da célula ~ genes expressos • Triture células e extraia o mRNA • Faça a transcrição reversa RNA • Utiliza-se cDNA, que é mais estável • Rotule cDNA das células de referência de verde (Cy3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy5) • P. Ex.: Cy3=Célula Normal Cy5=Célula Cancerosa • Hibridize ambas as amostras, células referência e alvo, em um único microarray cDNA

8. Fabricação do Array (1/4) Seleção das sondas (cDNA) a serem impressas no array Três dos milhares de cDNA conhecidos relevantes para a questão biológica investigada Obtidos de bibliotecas de cDNA Ou feitos a partir de amostras de mRNA

9. Fabricação do Array (2/4) Amplificação por PCR

10. Fabricação do Array (3/4) cDNAs são imobilizados em pontos específicos no substrato

11. Fabricação do Array (4/4) Spot contendo várias cópias de cDNA (sondas) de um gene específico

12. Preparação da Amostra Amostra de células de referência ou controle (RNA controle) Amostra de células a ser analisada (RNA experimental) 5’ AAAAA 5’ AAAAA 5’ AAAAA 5’ AAAAA Obs: Também pode ser realizados experimentos sem a amostra de controle e também para se comparar duas amostras de interesse Extrai RNAm 5’ AAAAA AAAAA 5’ 5’ 5’ AAAAA AAAAA

13. 5’ 5’ TTTTT TTTTT Síntese e Rotulação de cDNA (1/3) Primer TTTTT Transcriptase reversa dNTP 5’ 5’ AAAAA AAAAA Fita de cDNA é sintetizada Cada amostra é marcada com um corante diferente

14. 5’ 5’ TTTTT TTTTT 5’ 5’ AAAAA AAAAA 5’ 5’ AAAAA AAAAA Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) mRNA é degradado

15. DNA polimerase 5’ 5’ 5’ 5’ TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) Segunda fita do cDNA é sintetizada

16. 5’ 5’ 5’ 5’ TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) cDNA é desnaturado

17. Síntese e Rotulação de cDNA (3/3)

18. Hibridização (1/3) Amostra é colocada no array para hibridização Amostra sob investigação Microarray

19. Hibridização (2/3)

20. Hibridização (3/3) Lava o excesso de cDNA das amostras rotuladas

21. Scanning (1/3) Scanner

22. Scanning (2/3) Software do scanner sobrepõe imagens

23. Scanning (3/3) Software do scanner sobrepõe imagens

24. Experimentos com Microarrays - Resultados • O spot para o gene 1 = • Vermelho se há mais mRNA 1 nas células de teste • Verde se há mais mRNA 1 nas células de referência • Amarelo se são iguais • Preto se o gene não foi expresso • Dados em geral expressos na forma de uma matriz de níveis de expressão relativa intensidade vermelhaintensidade verde indexada pelos genes e as amostras das células de teste

25. Esquema de um microarray

26. Característica g1 g2gN-1gN Padrão 1 Padrão 2 Padrão 3 Padrão i Padrão m Dados de Microarray Classe Câncer Normal Câncer

27. Como é feita a análise ? • Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-se chegar a conclusões sobre a expressão gênica num determinado estado fisiológico

28. Algumas Aplicações • Descoberta de genes • Determinar quais genes estão sendo expressos em um determinado tipo de célula em um dado momento e sob certas condições • Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido doente) • Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião • Análise da regulação gênica • Identificação de doenças genéticas complexas • Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia • Detecção de mutação/polimorfismo

29. Outras Tecnologias • As técnicas de AM a serem descritas também podem ser aplicadas a dados de expressão gerados com outras tecnologias • MPSS (Massively Parallel Signature Sequence technology) • Brenner et al., 2000 • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) • Velculescu et al., 1995 • Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) • Freeman et al., 1999