Organizace a kontrola eukaryotického genomu

1. 2008 Organizace a kontrola eukaryotického genomu

2. Organizace genomu • I prokaryotický genom není jen nahá DNA uložená v cytoplasmě, ale je spojena s řadou proteinů a je skládána do smyček • Eukaryotický chromatin je však mnohem komplexnější • DNA jednoho „průměrného“ chromosomu člověka měří 6 cm (!) • DNA všech 46 lidských chromosomů měří 2 metry (!!)

3. Nukleosomy: „korálky na šňůře“ • První úroveň sbalení DNA realizují histony. Histonů je v chromosomu přibližně stejné množství jako DNA! • Histony jsou tvořeny převážně z + nabitých aminokyselin, jako je Arg a Lys, které se dobře vážou k negativně nabitým fosfátům DNA • Existuje 5 typů histonů: H1, H2A, H2B, H3 a H4 • Geny pro histony jsou prakticky totožné u všech eukaryot a dokonce i prokaryota mají podobné proteiny. Jedná se tedy jistě o velmi důležité a velmi konservativní geny

4. Eukaryotický genom

5. DNA eukaryotického chromosomu z vyvíjejícího se vajíčka mloka

6. Nukleosomy • Nukleosom je tvořen oktamerem histonů: H2A,H2B, H3 a H4 jsou každý obsaženy dvakrát • Histon H1 funguje jako svorka mezi jednotlivými nekleosomy • Histony opouští DNA pouze při replikaci… • …naopak při transkripci zůstávají připevněny k DNA – zdá se, že změnou tvaru a pozice nějak umožní RNA polymeráze čtení minus řetězce DNA

7. „Korálky na šňůře“ „Beads on a string“ N konec každého histonu směřuje ven z oktameru

8. DNA so obtáčí kolem histonu prostorový model

9. Histony • tradičně se myslelo, že přepisování DNA je řízeno transkripčními faktory sedající na 5´konec DNA • to je ale jen část příběhu • posttranslační úpravy histonů zřejmě odpovídají za regulaci genové exprese: na upravené histony nasedají proteiny, které určí, které části DNA budou přepsány RNA polymerázou (!) • velmi častá je acetylace N konců (to jsou ty, které „trčí“ ven) – acetylací se zmenšuje kladný náboj a histony jsou tak náchylnější k transkripci, neboť DNA se již na ně tak pevně neváže • schopnost acetylace je zřejmě klíčová pro život • pokud pokusně mají kvasinky zaměněný lysin na arginin (který si zachovává kladný náboj a nemůže být acetylován), kvasinky umírají

10. Histony • acetylace je dynamický proces • transkripční koaktivátory obsahují acetyltransferázy které histonové lysiny acetylují, korepresory mohou obsahovat deacetylázy, které acetyly odstraňují

11. Důležitost histonu H1 A: obvyklé sbalení DNA do 30nm vlákna E: bez H1 F: s H1

12. Vyšší úroveň organizace chromosomů • Nukleosomy tvoří vlákno 10nm • Oproti nahé DNA nukleosomy 7x zkracují délku DNA • jádro buňky člověka obsahuje 3,3x107nukleosomů • S pomocí H1 vzniká 30nm vlákno • Oproti nahé DNA 30nm vlákno 40x zkracuje délku DNA • Toto 30nm vlákno tvoří smyčky, které jsou připevněny k nehistonovým bílkovinám, které tvoří tzv. proteinové lešení 300nm silné • Dalšími ohyby a skládáním těchto smyček vzniká chromosom – jedna chromatida je cca 700 nm silná

13. 30 nm vlákno

14. 300 nm vlákno

15. Chromosom

16. Chromosomy • Ovšem i interfásový chromosom si udržuje jistou úroveň sbalení • Předpokládá se, že v interfázi zůstává zachováno 30nm vlákno, které nehistonové proteiny váží k nukleární lamině a snad i k nukleární matrix • Toto připevnění tak dává každému z interfázových chromosomů své přesné místo v jádře a zabraňuje tak zamotání jednotlivých chromosomů

17. Heterochromatin a euchromatin • I u interfázových chromosomů se některé jejich části nachází ve velmi kondensovaném stavu, tak že jsou barvitelné a pozorovatelné mikroskopem – jedná se o tzv. heterochromatin. Heterochromatinová DNA není přepisována • Euchromatin = „pravý chromatin“ je přepisován a nachází se v mnohem více rozvolněném stavu

18. Odlišní exprese genů u odlišných buněk • všechny buňky našeho těla vznikly mitózou, první buňkou byla zygota • (téměř) všechny buňky našeho těla obsahují stejný genom • jak je tedy možné, že se naše tělo skládá z cca 200 typů buněk? (svalové, nervové…?) • typická lidská buňka přepisuje v daném čase jen asi 20 % svých genů • velmi diferencované buňky, jako jsou svalové buňky,přepisují dokonce ještě menší procento genů

19. Odlišní exprese genů u odlišných buněk • jednotlivé buňky se tedy od sebe liší ani ne tak tím, že by obsahovaly odlišné geny, nýbrž tím, že odlišné geny jsou exprimovány • otázkou tedy jest, jak může RNA polymeráza najít v nezměrném moři písmen začátek správného genu, který má v této buňce v tomto čase přepsat

20. Geny • „housekeeping genes“ – geny, které se přepisují ve všech buňkách • patří sem např. geny pro histony, geny pro ribosomální proteiny atd.

21. v každé z těchto oblastí může proběhnout regulace genové exprese

22. Kontrola genové exprese

23. Kontrola genové exprese • Organizace chromatinu v jádře • DNA metylace. Zejména cytosin. Asi 5% cytosinů lidské DNA je metylováno. Velmi je metylována DNA neaktivního X chromosomu (Barrova tělíska). Metylované geny se předávají v jednotlivých mitózách dál, protože metylační enzymy jsou schopny je rozeznat a metylují dceřinný řetězec při replikaci – tapisérie metylovaných genů se tak při růstu tkáně předává dál. Metylace rovněž hraje roli při genovém imprintingu.

24. Kontrola iniciace transkripce • transkripce začíná vytvořením transkripčně iniciačního komplexu = transkripční faktory + promotor + RNA polymeráza • kontrolní elementy = segmenty nekódující DNA, na které se navazují transkripční faktory (striktně vzato je i promotor kontrolním elementem)

25. Kontrola iniciace transkripce

26. Role transkripčních faktorů • RNA polymeráza nemůže sama zahájit transkripci • jen jeden transkripční faktor rozeznává TATA box, jiné rozeznávají proteiny - buď jeden druhý nebo RNA polymerázu • takto ale probíhá transkripce jen pomalu a nedokonale • klíčem k rychlé transkripci jsou kontrolní elementy

27. Posilovače transkripce - enhancery • enhancery mohou být až tisíce pb vzdáleny od promotory proti proudu nebo i po proudu • mohou se dokonce nacházet i v intronech • do kontaktu s promotorem se dostávají ohybem DNA • aktivátor = transkripční faktor, který se váže na enhancer a popoří transkripci daného genu

28. Posilovače transkripce

29. Vazba transkripčních faktorů k DNA

30. Posttranskripční mechanismy kontrolují genovou expresi • mezi syntézou primárního transkriptu a činností aktivního proteinu v buňce se může nacházet řada kontrolních kroků • může např. dojít k alternativnímu sestřihu

31. Regulace degradace mRNA • prokaryotické mRNA mají typicky velmi krátkou životnost a enzymy je degradují po několika minutách - tím je také způsobeno, že bakterie pružně a rychle reagují na měnící se životní podmínky • u eukaryot mRNA přetrvává typicky hodiny, ale i dny a často i týdny • pověstná dlouhým životem je např mRNA pro oba globinové řetězce

32. Regulace degradace mRNA • degradace mRNA začíná enzymatickým zkracováním poly(A) konce • to rozběhne aktivitu enzymů, které odstraní čepičku • po odstranění čepičky nukleázy rychle odbourají mRNA od 5´ konce

33. Kontrola translace • většinou je regulována iniciace translace (připojení mRNA na malou podjednotku, připojení tRNAMet a připojení velké podjednotky) • např. v oocytu je velké množství předem připravených mRNA, které se po fertilizaci překládají ve správném čase a správném pořadí. • některé faktory zastavují translaci všech mRNA. Pokud např. ve vznikajícím erytrocytu je málo hemů, rewgulační proteiny zastavují celou translaci - většina mRNA je ovšem mRNA pro globiny

34. Kontrola translace • v oocytech mnoha organismů je připraveno množství mRNA - teprve po fertilizaci dojde k rychlé aktivaci translačních iniciačních faktorů. Výsledkem je explozívíní přepis mnoha mRNA • některé řasy a rostliny za noci zastavují translaci, kterou aktivuje až světlo

35. Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace • z insulinu musí být vyštěpena část řetězce, na jiné proteiny musí být navěšena sacharidová skupina, jiné proteiny mohou být aktivovány/deaktivovány reversibilním připojením fosfátové skupiny, jiné musí být dopraveny na správné místo v buňce - zde všude může probíhat regulace

36. Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace • např. cystická fibrosa je způsobena tím, že (díky mutaci v genu) protein, který má být normálně membránový a obsahuje v sobě kanál pro transport chloridových iontů, se nedostane na své místo do plasmatické membrány a v cytoplasmě je rychle degradován • např. cykliny musí mít krátkou životnost a musí být rychle degradovány, aby pracovaly správně

37. Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace • degradace začíná připevněním malé molekuly zvané ubiquitin na protein • obrovský proteinový komplex, zvaný proteasom, pak rozezná ubquitinovou „visačku“ a degraduje označený protein • cykliny, které vzdorují degradaci mohou způsobit rakovinu

38. Proteasom degraduje proteiny

39. Organizace genomu na úrovni DNA • U prokaryot většina DNA kóduje proteiny a jednotlivé geny jsou odděleny jen krátkými úseky nekódující DNA • U eukaryot naopak jen asi 1,5% (!) DNA kóduje proteiny • další malé procento kóduje nějaký jiný typ RNA než mRNA • Zbytek - nekódující DNA u eukaryot je tvořena částečně introny, ale především tzv. repetitivní DNA

40. Tandemové repetice • Tandemové repetice jsou krátké sekvence nukleotidů, opakované mnohokrát za sebou, např. • GTTACGTTACGTTACGTTACGTTACGTTAC • Sekvence GTTAC se může až několik set tisíckrát opakovat – evoluční význam tohoto jevu (je-li jaký) je záhadou. Možná se jedná jen o „odpadní“ DNA • Počet nukleotidů v sekvenci je obvykle 2 - 10

41. Tandemové repetice • Díky tomu, že tandemové repetice se opakují tolikrát za sebou, má tata část chromosomu poněkud jiné složení CG a AT než ostatní části chromosomu • Pokud je chromosom rozbit na malé kousky, tandemová DNA při centrifugaci vytvoří v centrifugační zkumavce pruh v poněkud jiné výšce, než zbytek chromosomu • Proto se této DNA začalo říkat „satelitní DNA“ • Nyní je tento termín užíván pro všechnu tandemovou DNA

43. Satelitní DNA • Satelitní DNA se dělí na tři typy: • Satelitní DNA (100 000 – 10 milionů opakování) • Minisatelitní DNA (100 – 100 000 opakování) • Mikrosatelitní DNA (10 – 100 opakování)

44. Satelitní DNA • Některé genetické choroby jsou způsobeny nesprávným počtem repetic • Fragilní X chromosom = mentální retardace. Počet repetic CGG na nepřekládaném začátku genu je u zdravých osob přibližně 30. U nemocných se tento triplet vyskytuje ve stovkách nebo i tisících opakováních. Počet opakování se zvyšuje v průběhu generací • Huntingtonova choroba: zde je triplet CAG překládán (do glutaminu). U zdravých osob je počet repeticí do 35, u nemocných 40 – několik set

45. Satelitní DNA • Mnoho satelitní DNA se nachází v telomerách a v centromeře

46. Vmezeřená repetitivní DNAIntrespersed Repetitive DNA • Tvoří 25% - 40% DNA savců • Repetice zde nenásledují těsně za sebou, ale jsou rozptýleny na různých místech genomu • Repetice je obvykle dlouhá stovky až tisíce pb a její jednotlivé kopie se obvykle mírně odlišují • Alu elementy: tvoří 5% genomu člověka. Jedná se o 300pb dlouhou repetici. Výjimka: Ale elementy se překládají do proteinu. Význam tohoto proteinu v buňce, je-li jaký, není znám

47. Genové rodiny • U prokaryot i u eukaryot se většina genů vyskytuje jako unikátní sekvence DNA, v jediném provedení v haploidním genomu • Některé geny se však vyskytují ve více než jednom provedení. Soubor stejných nebo velmi podobných genů se nazývá multigenová rodina • Genovou rodinu můžeme chápat jako tandemovou repetici s velmi dlouhou (=jeden gen) repetiční jednotkou

48. Genové rodiny • Některé genové rodiny obsahují identické geny tandemově uspořádané - např. geny pro histony • Většinou však genové rodiny neobsahují geny pro bílkoviny, ale pro RNA • Za příklad mohou posloužit rodiny pro rRNA – zde jedna jednotka obshuje geny pro tři rRNA (18S, 5,8S a 28S rRNA) • Tato jednotka se opakuje ve stovkách – tisících kopiích. Primární transkript je štěpen na tři rRNA. Takto má buňka materiál pro miliony ribosomů

49. Genové rodiny

50. Multigenové rodiny • Klasickým příkladem jsou geny pro globiny – proteiny, ze kterých se sestavuje hemoglobin • Rodina na chromosomu 16 obsahuje geny kódující různé verze α-globinu • Rodina na chromosomu 11 obsahuje geny kódující různé verze β-globinu • Různé verze globinových genů jsou přepisovány v různých fázích embryonálního a fetálního vývoje