Projekt lidského genomu

1. 2010 Marek Vácha Projekt lidského genomu

2. Lidský genom • má přibližnou velikost 3,2 Gb • z nichž je 2,95 Gb tvořeno euchromatinem. • 28% sekvencí je transkribováno do RNA a z těchto 28% je pouhých 5% přepisováno do proteinů; což je 1,1%-1,4% absolutní velikosti celého genomu člověka. • Přes 50% genomu je tvořeno repetitivními sekvencemi: 45% genomu je tvořeno jedním ze čtyř typů parazitických DNA elementů, 3% genomu tvoří repetice jen několika bází a 5% genomu je tvořeno recentními duplikacemi velkých segmentů DNA. • Většina parazitické DNA je tvořena reverzními transkripty z RNA. • Lidský genom tak z určitého úhlu pohledu připomíná moře repetitivních sekvencí s malou příměsí genů.

3. Projekt lidského genomu • přírodní vědy dosáhly působivých poznatků ve zkoumání external Universe, vnějšího světa • seriózně se mluví o 13 rozměrech a Hubbleův teleskop posílá fotografie i velmi vzdálených míst vesmíru • existuje ale doposud neprozkoumaný internal Universe, vesmír v nás, neméně rozsáhlý a neméně překvapivý

4. Projekt lidského genomu • Navržen v 80. letech, oficiální začátek 1990 • Navržen postup: • Genetická mapa • Fyzikální mapa • Úplná sekvence genomu člověka

5. Projekt lidského genomu • očekávaná doba trvání byla 15 let • očekávaná cena: 3 miliardy dolarů • 1981: publikována sekvence DNA lidské mitochondrie (16 569 pb)

6. Pomocné projekty • vytvoření nových technologií • zlepšení technik umožňující fyzikální a genetické mapování • zlepšení technik sekvenování DNA • konstrukce databází • sekvenování genomu pěti modelových organismů • E.coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster a Mus musculus • ELSI: Etické, Legální, Sociální Implikace

7. Personalizovaná medicína • od terapie již rozvinuté choroby snaha k preventivní medicíně, založené na znalosti rizika konkrétního člověka • ovšem jen málo chorob je způsobeno nesprávnou funkcí jediného genu, většinou jedná o multifaktoriální choroby

8. Projekt lidského genomu • problémy konstrukce genetické mapy člověka • člověka dost dobře nelze křížit • jen málokdy můžeme studovat rodokmeny s genetickou chorobou tak dobře, že jsme schopni vytvořit geneticko mapu člověka (VIZ drosophily s černým tělem a zakrnělými křídly)

9. Projekt lidského genomu • do 1970 byla pozornost zaměřena na rozdíly v strukturních genech • jenomže asi jen 1,5 % lidské DNA kóduje proteiny • a na správnou stavbu těchto proteinů je silný selekční tlak • od 70. let se začala zkoumat negenová DNA, která se výrazně liší od jednoho člověka ke druhému • …a byla vynalezena metoda zkoumající RFLPs

10. HUGO • 1988 vzniká HUGO • Human Genome Organization

11. Hierarchický přístup

12. Genetická mapa • Metoda je založena na relativních vzdálenostech markerů, které odpovídají frekvencím rekombinace (pravděpodobnosti crossing-overů) • Jako marker může sloužit buď gen a jeho fenotypový projev, nebo jakákoli jiná identifikovatelná sekvence, jako jsou RFLPs nebo mikrosatelity • Mapování skončilo nalezením cca 5000 markerů v celém lidském genomu

13. Fyzikální mapa • Se snaží vyjádřit vzdálenost mezi markery v absolutní míře, nejlépe v počtu nukleotidů • pro genom člověka byla dokončena cca 1994 • DNA celého chromosomu je rozstříhána dvěma restriktázami na identifikovatelné fragmenty, které se překrývají • Je užita próba, pomocí které jsou zjišťovány fragmenty, které se překrývají • Metoda je zvána procházení chromosomu (chromosome walking)

14. Procházení chromosomů

15. Chromosome walking • Prvním klonovacím vektorem pro zisk DNA bude YAC, který obsahuje fragmenty miliony pb dlouhé • Nebo BAC, umělý bakteriální chromosom, který může obsahovat fragmenty 100 000 – 500 000 pb dlouhé • Tyto fragmenty se užívají pro chromosome walking • Finální fragmenty jsou dlouhé asi 1000pb – ty se uchovávají v plasmidech nebo virech a již se dají snadno sekvenovat

16. Whole-genome sequencing • 1992 J.Craig Venter navrhuje vyhnout se genetickému a fyzikálnímu mapování a rozstříhat DNA celého genomu na krátké fragmenty, které by se potom přímo sekvenovaly • 1995 takto sekvenuje Haemophilus influenzae • 1998 zakládá Venter společnost Celera Genomics s heslem „Discovery can´t wait“ a stává se rivalem veřejného consortia • 2000 ve spolupráci s akademiky publikována sekvence Drosophila melanogaster

17. Whole-genom shotgun approachCelera Genomics

18. Veřejné consortium a Celera

19. Veřejné consortium a Celera

20. Veřejné consortium a Celera Genomics: remíza • V únoru 2001 Celera publikuje v Science sekvenování 90% genomu člověka • Ve stejném týdnu publikuje totéž veřejné consortium v časopise Nature • Spory: Veřejné consortium vystavuje výsledky sekvenování průběžně veřejně na síti… …a Celera tato data využívá • Celera Genomics doufá, že by nalezené geny patentovala – to by znamenalo obrovské zisky díky farmaceutickému průmyslu

21. Veřejné consortium x Celera GenomicsFrancis Collins Craig Venter

23. Poznámka pod čarou • v současnosti se Craig Venter věnuje úsilí vytvořit živou buňku z chemikálií • pokud se mu to podaří, bude to první živá buňka vytvořená z „neživota“ po 4 miliardách let

24. Rok 2001 • Cca 50 organismů je buď zcela nebo téměř sekvenováno • Asi 10 archeí • E.coli • Saccharomyces cerevisiae • C. elegans • Arabidopsis thaliana

25. Sekvenování DNASangerova metoda Pro tuto metodu se užívají fragmety DNA o délce 200 – 300pb, ale ne delší a polyakrylamidový gel (agarosový gel má příliš velké póry pro odlišení fragmentů lišící se jedinou bází)

26. Sekvenování DNASangerova metoda

27. Sekvenování DNASangerova metoda

28. Sekvenování DNASangerova metoda Fred Sanger dostal za tuto metodu druhou Nobelovu cenu (první již měl za objev struktury insulinu)

29. Sekvenování DNA dnes Primer pro každou ze čtyř reakcí je značen odlišnou fluorescenční barvou – každá DNA končící dideoxy bází má jinou barvu – zde A, C, G, T. Na rozdíl od klasické elektroforézy probíhá nyní elektroforéza v kapiláře, a laser „za pochodu“ – tak jak DNA postupuje gelem detekuje jednotlivé barvy

31. Sekvenování DNA dnes • Protože laser snímá jednotlivé kroužky barevné DNA za pochodu, stačí krátký gel, kterým neustále prochází DNA – laser stále zaznamenává stále delší a delší (= pomalejší a pomalejší) kusy DNA, zatímco kratší jsou již dávno z gelu venku • Díky barvám stačí jedna kapilára (v klasické podobě musely být čtyři pruhy v jedné gelové destičce)

32. Sekvenování DNA dnes

33. Galerie genomů

34. Galerie genomů

35. Galerie genomů

39. Počty genů • Mycoplasma genitalium (genom pouhých 580 000 pb) – 517 genů • asi jen 265 – 350 genů jsou opravdu potřebné k životu

40. Počty chromosomů • jsou u různých organismů velmi různé • mravenec Myrmecia pilosula má pouze 1 pár chromosomů (samec jen jediný chromosom) • kapradina Ophioglossum reticulatum 630 párů chromosomů

41. Počty chromosomů u ptáků • nejnižší počet chromosomů: dytík úhorní (Burhinusoedicnemus) 2N = 40 • nejvyšší: ledňáček říční (Alcedoatthis) 2N = 132 • většina ptáků kolem 80 chromosomů • chromosomy u ptáků jsou však velikostně diferencovány na makrochromosomy a mikrochromosomy • hustota genů v mikrochromosomech je výrazně vyšší – mikrochromosomy tvoří jen 18 % - 23 % genomu, ale obsahují více než polovinu genů (Gaisler, J., Zima, J., (2007) Zoologie obratlovců. Academia, Praha, str. 450)

42. Lidský genom

43. Lidský genom

44. Lidský genom • 41% genomu tvořeno GC páry, 59% jsou AT • Přibližně polovinu genomu tvoří repetice • Geny tvoří cca čtvrtinu genomu, jen asi 1,5% ale kóduje proteiny, rRNA a tRNA, zbytek jsou introny

45. Lidský genom • Geny tvoří cca čtvrtinu genomu, jen asi 1,5% ale kóduje proteiny, rRNA a tRNA, zbytek jsou introny • u bakterií 90 % genomu kóduje proteiny, 10 % jsou regulační oblasti • Caenorhabditis má 27 % genomu obsazeno geny kódující proteiny • Drosophila 13 %

46. srovnání distribuce genů ve náhodně zvolené oblasti o velikosti 90 000 pb u různých organismů. Pro srovnání je uvedeno i 500 000 pb lidského chromosomu 21. Introny jsou naznačeny tence, šipky ukazují směr transkripce.

47. Repetitivní DNA u různých organismů • u bahníků a ocasatých obojživelníků je obsah repetitivní DNA až 50 % – 90 %! • u ptáků je obsah repetitivní DNA 15 % - 20 % • u savců je obsah repetitivní DNA 30 % - 50 %

48. Lidský genom • Stovky genů člověka vykazují bakteriální původ a do lidského genomu se dostaly zřejmě někdy v různých fázích evoluce obratlovců horizontálním transferem. Několik desítek genů zřejmě pochází z transpozabilních elementů • Ačkoli je přibližně polovina genomu člověka tvořena transpozabilními elementy, zdá se, že v hominidní linii tyto elementy pozvolna ztrácely na aktivitě. V genomu člověka se zdá že jsou již všechny zcela neaktivní

49. Dispersed repeats(Jobling, M.A., et al. (2004) Human Evolutionary Genetics. New York, Garland Science

50. Vyložení pojmů • mezi repetitivní sekvence se řadí • transposony • u člověka již neaktivní • cut-and-paste mechanismus • přes DNA intermediát • retrotransposony • u člověka ještě občas aktivní • copy-and-paste mechanismus • přes RNA intermediát