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Técnicas de identificación de micobacterias diferentes a M tuberculosis

Técnicas de identificación de micobacterias diferentes a M tuberculosis. Servicio Micobacterias Inst. Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”. Colonias como migas de pan, secas, sin pigmentación y desarrollo lento .

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Técnicas de identificación de micobacterias diferentes a M tuberculosis

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Presentation Transcript

  1. Técnicas de identificación de micobacterias diferentes a M tuberculosis Servicio Micobacterias Inst. Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”

  2. Colonias como migas de pan, secas, sin pigmentación y desarrollo lento Identificación de cultivos positivos en medio sólido Características culturales características culturales compatibles con M tuberculosis Se encauza para tipificación

  3. Bioseguridad Cabinas de seguridad biológica tipo IIA con salida al exterior, UPS y validación anual Antesala que separe el área de trabajo del resto del laboratorio Pruebas bioquímicas Características microscópicas Características microscópicas Características microscópicas Niacina Niacina Catalasa Nitrato reductasa

  4. Identificación de cultivos positivos en medio sólido Características culturales Colonias lisas y pigmentadas o que toman el color del medio No es M tuberculosis Se encauza para tipificación si es necesario

  5. Identificación de cultivos positivos en medio líquido Si se observan grumos se puede sospechar en M tuberculosis Si se observa turbidez pareja se puede sospechar de micobacteria ambiental Características microscópicas

  6. Precisión de la observación de cuerdas en extendidos de caldos positivos para la identificación de M tuberculosis Un resultado de sensibilidad a isoniacida da mayor precisión a la identificacion • Yagupsky PV et al. J Clin Microbiol, 1990, 28:1451-53 • Morris AJ, Reller LB. J Clin Microbiol, 1993, 31: 2353 – 54 • Badak FZ et al. J Clin Microbiol, 1999, 37:4189-91 • Attorri S et al J Clin Microbiol, 2000, 38:1426 – 29 • Coelho AGV et al J Bras Pneumol,2007, 33: 707-11

  7. Tests inmunocromatograficos de flujo lateral (ICA : Immunochromatographic assay ) para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis • * Es un sistema de doble anticuerpo * Test disponibles: • CAPILIA TB (Tauns laboratorios, Inc., Numazu, Japan) • Tibilia rapid test (Hangzhou, China) • SD bioline Ag MPT 64 rapid test (Standad Diagnostic, • South Korea) • MGIT TBc ID test (Becton Dickinson) • *Se puede realizar de medio líquido y sólido • * Límite de detección: 105 UFC/ml

  8. Tests inmunocromatograficos de flujo lateral (ICA : Immunochromatographic assay ) para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis Anticuerpo policlonal anti inmunoglobulina de raton inmovilizado en la membrana (captura el exceso de monoclonal indica que está en buenas condiciones y que ha migrado correctamente) Segundo anticuerpo raton anti MPB64 (reconoce otro epitope del antígeno) inmovilizado en la membrana Raton anti MPB64 conjudado con partículas de oro coloidales 15 minutos Algunas cepas de BCG (Glaxo, Pasteur, Tice) no expresan MPB64 Se encontraron mutantes de M. tuberculosis que no expresan el Ag Capilia, Tauns Japon ,Nippon BD Co Ltd Standards Diagnostics, Corea 80 – 100 µl de suspensión bacteriana

  9. M. avium M.tuberculosis M.kansasii M.tuberculosis M.tuberculosis

  10. Evaluación del test de inmunocromatografía lateral para la identificación de Mycobacterium tuberculosis en medio lìquido Brent A. et al journal of Clinical Microbiology Dec 2011, 4343-4346

  11. Datos del poster CAPILIA Nuestra experiencia 1º etapa: Capilia TB test (Tauns Laboratories, Japan) vs PRA. Participaron 3 laboratorios de referencia de CABA y LNR. Se investigaron: - 349 cultivos positivos en MGIT 960 - 192 aislamientos de micobacterias ambientales Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos. PRA ICL CAPILIA TB Sensibilidad= 99,1% (IC 95% 97,8 -100) Especificidad= 100% (IC 95% 99,8 -100) 3 aislamientos dieron falsos negativos un Mycobacterium tuberculosis y dos de M bovis-BCG. 2 de los 323 (0,6%) cultivos de M. tuberculosis contenían también M. avium Tiempo requerido para crecimiento e identificación: Muestras B (+) (n= 203): 11 (2-30) días. Muestras B (-) (n= 138): 17 (5–39) días.

  12. 2º etapa: MGIT TBCID test vs PRA Se estudiaron 97 aislamientos de pacientes con riesgo de micobacteriosis o tuberculosis resistente a drogas , en LRN. Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos. PRA ICL MGIT TBc ID Sensibilidad= 97,7% (IC 95% 93,9 -100) Especificidad= 100% (IC 95% 95,5 -100) Falsos negativos 2 aislamientos de M tuberculosis. 1 de 84 (1.2%) aislamientos de M tuberculosis también contenía M intracellulare.

  13. Identificación molecular de especies de micobacterias a partir de cultivo Moléculas útiles para identificación de especies de micobacterias Blancos específicos para Complejo M tuberculosis - IS6110 - MPB 64 Blancos comunes a las micobacterias 16S rRNA, ITS 16S – 23S rRNA, 16S rDNA Proteína de shock térmico (hsp 65) DNA Girasa B (gyr B) RNA polimerasa (rpoB) Superóxido dismutasa (sodA) Sistema de reparación y recombinación de DNA (recA) Métodos: -PCR / nested PCR -PCR real time - Accu Probe (Gen Probe) - LIPAs - PRA

  14. LUZ AccuProbe: Se basa en la hibridación del rRNA de las micobacterias a sondas DNA especie específicas. Solo nos permite identificar las micobacterias más importantes desde el punto de vista clínico RIBOSOMAS destrucción química de la marca no hibridizada * * * * * SONDA ADN-ESTER DE ACRIDINA ARNr + H2O2 + OH- S y E > 90%

  15. LIPAs hibridación en tiras con sondas 1) Extracción ADN Centrifugar 20’ a 14000 rpm Hervir a 100ºC 30 min • 2) Amplificación de blancos específicos con primers biotinilados • ITS 16S-23S rRNA • rRNA 23S • 16S

  16. Especial cuidado con la temperatura de hibridación, máxima desviación tolerada +/-1 ºC. Orientar bien la tira y ver que queda totalmente sumergida. 3) Hibridación sobre tiras de nitrocelulosa 5) Interpretación de resultados 4) Reacción colorimétrica

  17. INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Belgium) Amplifica la región espaciadora entre los genes RNA ribosomal 16S - 23 S se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie 16 especies prevalentes

  18. GenoType Mycobacterium (Hain, Germany) Amplifica la región 23 S del gen RNA ribosomal se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada micobacteria CM 13 especies prevalentes

  19. identificación 16 especies raras AS InnoLIPA GenoType Concordancia 86% 90-96% Makinen J, et al Clin Microbiol Infect 2006, 12:481-483. Lee AS, et al J Med Microbiol, 2009,58:900-4. Safianowka A, et al. Pneumonol Alergol Pol. 2010;78:363-8.

  20. PCR-reverse dot blot hybridization (RDBH) Amplifica la región 16 S del gen RNA ribosomal se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie 22 especies 340 aislamientos 99% de concordancia con secuenciación Xueqiong Wu,l, et al J. Clin. Microbiolo 45: 1898, 2007

  21. PRA Amplificación de un fragmento del gen hsp65 Restricción enzimática Hae III Bste II Electroforesis en gel de agarosa Tinción de ADN (bromuro de etidio)

  22. Segmentos cortados por la Enzima BstE II Enzima Hae III Mycobacterium abscessus

  23. Evaluación en la rutina de trabajo Experiencia I (2004) todos los aislamientos recibidos n: 633 93% de los aislamientos que llegan a nuestro laboratorio en un lapso de 3-7 días Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

  24. Evaluación en la rutina de trabajo Experiencia II (2005-2007) aislamientos de especies no resueltas en la experiencia anterior n: 170 84 Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

  25. Secuenciación: Para la identificación molecular de micobacterias además de la secuenciación del gen 16S rRNA, considerado gold stsndard, se han propuestos otros genes: ITS 16s – 23S rRNA, y los genes 23S rRNA, hsp65, rpoB, sodA, recA. Kit comercial MicroSeq 500 (Aplied Biosystem) Comparación con base de datos GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbanklindex.html) EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/) DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) Es un técnica que requiere equipamiento y reactivos muy costoso, y personal muy entrenado

  26. * El uso de test moleculares para diferenciar entre CMTBC y otras micobacterias es importante para elegir un tratamiento adecuado sobretodo en países donde la prevalencia de tuberculosis es baja y la enfermedad por otras micobacterias son más frecuentes. El uso en países con alta prevalencia de tuberculosis donde la mayoría de los casos son B(+) es menos útil * En pacientes con inmunosupresión severa el uso de estas técnicas permite discernir entre tuberculosis y micobacteriosis

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