Enzime Generalităţi. Nomenclatură şi clasificare. Structură. Markeri tumorali

1. Enzime Generalităţi. Nomenclatură şi clasificare. Structură. Markeri tumorali

2. Enzimele sunt substante chimice complexe de natură organică-proteinecoloidalsolubile  elaborate de plante,  animale  si microorganisme,capabile să mărească viteza reactiilor  chimice ce se desfăsoară însistemele biologice, fără să se consume în cursul lor.Denumirea de enzime a fost dată de către Kuhne (1878) si provine de laexpresia "en zima = în levură" (în 1. greacă), pornind de la faptul că dindrojdii s-au extras pentru prima dată enzime.Dar cunostinte sistematice în acest domeniu s-au obtinutîncepând cu identificarea primelor enzime: amilaza din malt (Kirchoff,1814), amilaza salivară (Leuchs, 1831) si pepsina (Schwann, 1836).

3. Toate enzimele cunoscute până în prezent sunt substanţe de natură proteică şi îndeplinesc rol de catalizatori ai transformărilor biochimice din celula vie. • Fiind biocatalizatori, enzimele prezintă toate proprietăţile generale ale catalizatorilor chimici: - măresc viteza reacţiilor chimice - activitatea catalitică se manifestă la concentraţii mici, mediul de reacţie conţinând concentraţii relativ mari de substrat; - la sfârşitul transformării se regăsesc în mediu nemodificaţi din punct de vedere cantitativ şi calitativ.

4. Enzimele intracelulare sunt acele enzime care sunt produse si îsidesfăsoară activitatea chiar în celulele în care sunt biosintetizate. • Enzimele intracelulare pot fi legate prin adsorbtie si în acest caz se numescbioenzime, iar când sunt legate profund de celule, de protoplasmacelulei, prin legături chimice, se numesc desmoenzime.

5. Enzimele extracelulare sunt enzimele care, deşi biosintezate în celule, sunteliminate în lichidele din organism sau în mediile de cultură, exercitându-şiacţiunea la acest nivel. Aceste enzime se extrag cu uşurinţă de la loculde acţiune, iar activitatea lor este deplină. • În organism există enzime fie independent de prezenţa substratului fie enzime care sunt sintetizate în caz de nevoie.

6. Structura enzimelor • Numeroase enzime insă au o structură binară care constă dintr-ocomponentă proteică, denumită apoenzimă şi una sau mai multecomponente neproteice, denumite cofactori. Complexulapoenzimă+cofactoreste denumit holoenzimă şi este activ din punct de vedere catalitic. Prinîndepărtarea cofactorului, rămâne componenta proteică inactivă în formaliberă. • În structura holoenzimei, cofactorul imprimă specificitate de acţiune.

7. Structura enzimelor • După natura chimică şi modul lor de legare la apoenzimă, cofactorii seclasifică in: coenzime, grupări prostetice, ioni metalici. • · coenzimele sunt compuşi organici - majoritatea derivaţi de la vitamine -care se ataşează temporar la apoenzimă prin legături necovalente şicare sunt uşor disociabili de aceasta.

8. Structura enzimelor • grupările prostetice sunt substanţe organice fIxate pe apoenzimă şicare disociază greu; imprimă mecanismul unor procese enzimatice ca:transportul de electroni, de grupări – NH2, acetil etc.

9. Structura enzimelor • ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funcţiei catalitice aunor enzime, se numesc şi metal-enzime . Unele enzime pot conţine chiar doi ioni metalici.

10. Specificitatea enzimelor • Seinţelege prin specificitatea unei enzime proprietatea sa de a acţionapreferenţial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cucaractere chimice comune.

11. Cinetica reacţiilor enzimatice • Studiul cineticii enzimatice este deosebit de important deoarece permitecunoaşterea mecanismelor reacţiilor enzimatice, inţelegerea şiclasificarea proceselor metabolice şi importanţa lor fiziologică pentruorganism.

12. CLASIFICAREA ENZIMELOR • 1) oxidoreductazele - enzime ce catalizează reacţiile de oxidoreducere ce au loc în organismele vii; • 2) transferazele - enzime ce catalizează reacţii de transfer ale unor grupe de atomi ce pot fi şi grupe funcţionale de la un substrat la altul, fără ca aceste grupări să existe libere în timpul procesului; • 3) hidrolazele - enzime ce catalizează scindarea diferitelor legături covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă; • 4) liazele- enzime ce catalizează reacţii de adiţie a unor grupe de atomi la molecula substratului sau clivarea acestor grupări cu rearanjarea ulterioară a valenţelor; • 5) izomerazele - enzime care catalizează diferite reacţii de izomerizare a substratelor; • 6) ligazele sau sintetazele - enzime ce catalizează formarea unor noi legături chimice carbon – carbon sau carbon – heteroatom, în majoritatea cazurilor utilizându-se energia stocată în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP.

13. Clasahidrolazelor • Din această clasă fac parte enzimele care hidrolizează proteinele pană laaminoacizi, polizaharidele pană la monozaharide şi lipidele pană la acizigraşi şi glicerol.

14. Clasahidrolazelor • Fosfolipazele - fosfatidilcolina,fosfotidiletanolamina • Colinesterazele scindează hidrolitic esterii colinei, prezenţi indeosebi inţesutul nervos, sinapse, eritrocite.

15. Principalimarkeri tumorali

16. Incidenţa cancerului 10 milioane cazuri noi /an (prognoza OMS în urmatorii20 de ani: creştere la 15 milioane cazuri noi /an) 7 milioane decese /an(prognoza OMS în urmatorii20 de ani: creştere la 10 milioane decese /an)

17. Markeri tumorali circulanti • Alfafetoproteina (AFP) • Antigene carboidrato 15-3 (CA 15-3) • Antigene carboidrato 19-9 (CA 19-9) • Antigene carboidrato 125 (CA 125) • Antigene carcinoembrionario (CEA) • Antigene prostatico specifico (PSA) • Calcitonina (CT) • Cromogranina A • Enolasi neurono-specifica (NSE) • Citocheratina 19 (Cyfra 21-1) • Gonadotropina corionica umana (HCG) • S-100 • Tireoglobulina

18. 1. Antigene tumorale TSA-Tissue Specific Ag - Antigene care aparţin doar celulelor tumorale TAA-Tissue Associated Ag - Antigene care aparţin şi celulelor normale Deşi nu toate celule neoplazice dispun de markeri deosebiţi de cei fiziologici, la majoritatea pot fi identificate structuri antigenice diferite, numite neoantigene. Aceste structuri pot fi înşirate în următoarele 2 grupe: Antigenele retrogenetice: în condiţii fiziologice ele sunt exprimate exclusiv pe suprafaţa celulelor embrionare, dar nu şi a celor de după naştere→ antigene oncofetale (-fetoproteina (AFP) şi antigenul carcinoembrionar (CEA); pot reapare după naştere Antigenele de diferenţiere: apar numai într-o fază determinată a maturaţiei unor serii celulare (elementele imature din leucemii).

19. 2. Markeritumorali - definiţie Markerul tumoraleste substanţa produsă de către un ţesut tumoral, care rămâne în / pe celula producătoare (markeri celulari, de ex.crz Ph,p53, receptori hormonali) sau este secretată în umorile înconjurătoare (markeri umorali / solubili în lichide biologice) şi a cărei identificare / dozare este utilă in diagnosticul sau management-ul clinical afecţiunilor canceroase.

20. 2. Markeritumorali - istoric • 1846 - proteina Bence Jones a fost descrisăca marker pentru mielomul multiplu • 1930 - gonadotropina chorionică (hCG) a devenit un test standard, iniţial în diagnosticul şi apoi în monitorizarea choriocarcinomului • 1963 - AFP a fost identificatăca marker pentru carcinomul hepatoceluar (Tatarinov) • 1965 - CEA a fost identificatca antigen oncofetal (Gold şi Freedman). • din 1975 – tehnica anticorpilor monoclonali este folosită pentru a descoperi noi markeri tumorali (Kohler si Milstein)

21. 2. Markeri tumorali - utilitate • screening– populaţie la risc(Calcitonina in familii cu afecţiuni neoplazice endocrine multiple tip 1, AFP la pacienţii cu ciroze hepatice alcoolice - risc înalt de carcinom hepatocelular) • diagnosticul tumorilor, pentru completarea simptomatologiei clinice (5 HIAA urinar în sindr. carcinoide) • stabilirea prognozei(în unele cazuri, concentraţia markerului este în strânsă relaţie cu masa ţesutului tumoral) • monitorizarea răspunsului la tratament chirurgical, chimioterapic sau radioterapic • stabilirea recurenţei / recăderii / metastazării

22. 2. Marker-ultumoral ideal Efectuat din sânge sau alt lichid uşor de prelevat, cu rezultat pozitiv doar pentrupacienţii cu cancer (SPECIFICITATE), corelat cu stadiulşi răspunsul la tratament (SENSIBILITATE), uşor de măsurat şi reproductibil. Sp=[RN/(RN+FP)]x100 Se=[RP/(RP+FN)]x100 NU EXISTĂ MOMENTAN Markeri Tumorali IDEALI !!

23. 2. Marker-ul tumoral ideal Specificitatea (Sp) unui test diagnostic - este probabilitatea ca un individ fără boala respectivă să aibă rezultatele testului negative: Sensibilitatea (Se) unui test diagnostic - este probabilitatea ca un individ bolnav să aibă rezultatele testului pozitive:

24. Rata fals negativă (RFN) - este probabilitatea ca un individ bolnav să aibă rezultatele testului negative: RFN=[FN/(FN+RP)]x100 Rata fals pozitivă (RFP) - este probabilitatea ca un individ fără boala respectivă să prezinte rezultate pozitive ale testului: RFP=[FP/(FP+RN)]x100 Valoarea predictivă pozitivă (VPP), sau probabilitatea posttest, este probabilitatea ca un individ cu valori pozitive ale testului să prezinte boala (~ Sp crescută a testului): VPP=[RP/(RP+FP)]x100 Valoarea predictivă negativă (VPN) - este probabil. ca un individ cu valori negative ale testului să nu aibă boala (~ Secrescutăa testului): VPN=[RN/(RN+FN)]x100 Acurateţea globală a testului (AG) - este probabilitatea globală ca valorile pozitive sau negative ale testului să identifice corect prezenţa/absenţa bolii: AG=[(RN+RP)/(RN+RP+FN+FP)]x100 2. Marker-ul tumoral ideal - caracteristici

25. 3. Markeri tumorali – clasificare – utilitate în practica clinică • Antigene oncofetale – CEA şi AFP • B. Carbohidraţi – CA 15-3, CA 19-9, CA 125, CA 72-4, TPA, PSA • C. Hormoni– hCG, Calcitonina • D. Proteine non-oncofetale – Tireoglobulina, Feritina, b2-mg, S-100, Bence Jones • E. Enzime – NSE, TK • F. Markeri genetici

26. 3A. Antigene oncofetale – CEA În viaţa embrionară se produce în pancreas şi în tractul gastro-intestinal. Este o glicoproteină complexă – 180 kD cu 45-60% carbohidraţi, fixată în membrana celulei neoplazice (de unde se eliberează în sânge)

27. 3A. Antigene oncofetale – CEA • Fumatori, • Carcinoame colorectale, • Carcinoame mamare, • Carcinoame polmonare, • Carcinoamul pancreatic

28. Markeri tumorali circulanti • Alfafetoproteina(AFP) – • Antigene carboidrato 15-3(CA 15-3) • Antigene carboidrato 19-9 (CA 19-9)-

29. 3A. Antigene oncofetale – AFP Este o glicoproteină de origine oncofetală, sinteza ei fiind suprimată la adult. În cursul vieţii intrauterine se formează în sacul vitelin, iar mai târziu în ficat şi tract gastro-intestinal (sinteza max - în săpt 14-20), fiind o proteină plasmatică; în serul mamei concentraţia max este atinsă în săpt 35-38).

30. 3A. Antigene oncofetale – AFP • Hepatite virale, • Cirozahepatica, • Hepatocarcinom, • Tumori testicolare, • Tumori ovariene

31. 3B. Antigene carbohidraţi – CA CA 125 (1981) este o glicoproteină, prezentăîn 80 %din carcinoamele ovariene nemucinoase (seroase, nediferenţiate). Este prezent în epiteliul: ovarian, pancreas, vezica biliară, stomac, bronhii, rinichi, colon. Se găseşte în cantităţi crescute în lichidul amniotic, laptele şi serul femeilor însărcinate. Cauza frecventă a rezultatelor fals pozitive este endometrita, diabetul zaharat, ciroza hepatică, insuficienţa renală cronică. Este indicat mai ales pentru monitorizarea evoluţiei boliişi a terapiei.

32. Ag gastro-intestinalCA 72-4 Este o GP (400 kD). Este prezent în: stomac, ovare, celule epiteliale pulmonare. CA 72-4 poate fi folosit pentru monitorizarea carcinomului gastric postoperator pentru că indică devreme recidiva bolii.

33. Ag gastro-intestinalCA 19-9 Este un gangliozid, CA19-9 este prezent în celulele epiteliale şi mucoase: pancreas, stomac, intestin CA19-9 este markerul de primă linie în carcinomul pancreatic. În alte boli maligne prezintă o sensibilitate mai scăzută

34. CA 15-3 • Este o mucină (GP) polimorfăepitelială (300 - 450 kD) • CA 15-3 este folosit pentru monitorizare postoperatorie, pentru că indică recidiva cu câteva luni înainte ca diagnosticul clinic să fie posibil.

35. Antigenul polipeptidic tisular (Tissue Polypeptide Antigen) - TPA Este un antigen asociat tumorilor universal, deoarece prezintă valori crescute indiferent de locul tumorii. Este prezent în: ţesuturile fetale, placentă, epiteliul organelor cavitare. Poate fi identificat în urină, salivă, lichidul de lavaj bronho-alveolar, ascită. Aceste determinări sunt de multe ori mai valoroase decât determinările din ser.

36. Antigenul specific prostatic (Prostate-Specific Antigen)- PSA Este o glicoproteină, sintetizată de celulele epiteliale prostatice şi secretată în lichidul seminal. Este un marker specific de organ, care poate fi folosit şi pentru screening-ul grupelor de risc (bărbaţi cu vârste cuprinse între 50-70 ani), mai ales în asociere cu tuşeul rectal PSA poate fi folosit şi pentru monitorizarea terapiei şi detectarea recidivelor.

37. 3C. MARKERI TUMORALI – HORMONI • Sinteza de hormoni peptidici este o trăsătură comună a celulelor canceroase. Cele mai multe studii se referă la cancerul bronşic: 10% din pacienţii cu această boală prezintă sinteză ectopică de hormoni. • Tumorile celulelor APUD („amine precursor uptake and decarboxylation”) - “APUD-oamele” au o activitate intensă de sinteză hormonală. • Aceste tumori sunt: cancerul bronşic cu celule mici, carcinomul celulelor Langerhans (insulinomul)

38. Carcinoidul Tumoră din grupa APUD-oamelor, se dezvoltă din celulele enterocromafine în tractul gastrointestinal, pancreas, căi biliare = sistem de celule cu caracteristici histochimice şi raspândire heterogenă, cu rolul de a sintetiza amine biogene: dopamina şi noradrenalina.

39. Human Chorionic Gonadotropin - hCG • Este un hormon GP heterodimeric (cu două subunităţi: a şi ß ) produs în mod normal de către trofoblaştii placentari. • Determinarea hCGeste utilizată de obicei pentru confirmarea sarcinii. • A fostintrodus în screening-ul matern, valori crescute fiind asociate (+AFP +E3) cu riscul crescut de sindrom Down, Eduards

40. Calcitonina • Calcitoninaeste secretatăde celulele parafoliculare C ale tiroidei. Efectul principal este de scădere a calciului seric, prin inhibarea resorbţiei osoase şi stimularea eliminării urinare a calciului. • Creşterea concentraţiei serice a calcitoninei apare în variate situaţii patologice, incluzând sindroamele mieloproliferative.

41. 3D. Peptide: lanţurile uşoare, Tireoglobulina, Feritina, b2-mg, Proteina S-100 Proteina(/-ele) Bence Jones Este considerată primul marker tumoral(cunoscut din 1846: încălzirea la 60°C -> pp--100°C dizolvare -> re pp prin răcire) 50-80% dintre pacienţii cu mielom multiplu au BJ+. Mai puţin frecvet, apar însăşi în alte tipuri de malignităţi: limfoame, insuficienţa renală cronică

42. Tireoglobulina Funcţia acestei glicoproteine este aceea de a transporta hormonul tiroidian în timpul sintezei şi acumulării acestuia în tiroidă. Tireoglobulina creşte la majoritatea bolnavilor cu carcinom tiroidian, de aceea această proteină este folosită ca marker al cancerului tiroidian. Cea mai mare sensibilitate diagnostică o are în tumorile tiroidiene diferenţiate (>90%). Tireoglobulina este importantă mai ales în monitorizarea evoluţiei cancerului tiroidian: este folosită în asociaţie cu scintigrafia sau o poate chiar înlocui.

43. Feritina Proteina responsabilă de depozitarea fierului În ţesuturile tumorale se găsesc mai ales izoferitinele acide. În caz de exces de fier, ţesuturile tumorale sintetizează subunităţi H, iar ţesuturile normale subunităţi HL. În următoarele neoplazii feritina creşte în 40-70% din cazuri: leucemia acută; limfom Hodgkin; carcinom pulmonar; carcinom de colon; carcinom hepatic; carcinom de prostată.

44. b 2 microglobulina Este o proteină mică,se găseşte pe membranele tuturor celulelor diferenţiate. Este prezentă în lichidele biologice în concentraţie scăzută (ser, urină, salivă, lcr, etc). Este eliminată de rinichi în proporţie de 98%. Cauzele creşterii b-2-microglobulinemiei: sinteza crescută; distrugerea celulelor / turn-over crescut în celulele sistemului imun; scăderea ratei filtrării glomerulare. În cazul tumorilor, concentraţia b-2-mg creşte datorită sintezei crescute în ţesutul tumoral, dar poate creşte şi datorită inflamaţiei sau alterărilor suferite de ţesuturile din jurul tumorii. Creşterea concentraţiei b-2-mg nu este specifică tumorilor; apare şi în inflamaţii, în boli renale, hepatice, infecţii, SIDA etc.

45. Proteina S-100 Proteina S-100 detectează cu o mare sensibilitate bolile sistemului nervos central. Ca marker tumoral este folosită în: tumori primare şi metastaze monitorizarea melanomului. Nivelul S-100 se corelează exact cu stadiul clinic al melanomului şi este folosit ca factor de prognostic şi pentru monitorizarea terapiei melanomului.

46. 3E.Enzime Celulele canceroase au o activitate enzimatică diferită atât cantitativ, cât şi calitativ. LDH, Amilaza, CK, g-GT, nu sunt utile pentru diagnosticul primar al tumorilor, dar sunt utilizate pentru monitorizarea terapiei şi evoluţiei bolii, ca markeri de linia a doua Câteva enzime şi izoenzime însă, pot fi folosite şi ca markeri tumorali de primă linie

47. 3E.Enzime – markeri tumorali: NSE Enolaza neuronspecifică - NSE87 kD, este o enzimă citoplasmatică cu rol în metabolizarea intracelulară a glucozei, prezentă în toate celulele organismului. Tumorile însoţite de diferenţiere neuro-endocrină (neuroblastom, carcinom pulmonar cu celule mici) secretă în sânge o cantitate însemnată de NSE ca rezultat al distrugerii celulare intense. Cea mai importantă indicaţie a NSE: monitorizarea evoluţiei şi terapiei cancerului pulmonar cu celule mici

48. 3E.Enzime – markeri tumorali:dezoxiTimidin-kinaza - dTK În celulele organismului uman există trei izoenzime de TK. Activitatea enzimatică se corelează cu gravitatea bolii; poate fi folosită pentru stadializarea bolii şi alegerea tratamentului, precum şi pentru evaluarea eficacităţii terapiei. TK este folosită mai ales în boli limfoproliferative (limfom Hodgkin, limfom nonHodgkin, leucemie acută şi cronică, mielom), tumori cerebrale, carcinom pulmonar cu celule mici, cancer mamar TK creşte şi în câteva boli virale (virus herpetic, citomegalic, HIV). Este folosită şi pentru monitorizarea acestor boli.

49. 3F. MarkeriGenetici Oncogene = gene care atunci când sunt exprimate anormal de intens sau când suferă mutaţii,contribuie la transformarea unei celule normale într-o celulă canceroasă (angajată în mitoză necontrolată).

50. Gene supresoare tumorale • Inhibă sau frânează creşterea celulară şi ciclul celular,prevenind dezvoltarea tumorilor • Mutaţii ale acestor gene determină ignorarea din partea celulei a unuia sau mai multor componenţiai reţelei de semnale inhibitorii, înlăturând “frânele”ciclului celular, ceea ce conducela o creştere celulară necontrolată - cancer.