Analisi degli alimenti (LMC 7: ANALISI VARIE) Giorgio Bonaga

1. Anno Accademico 2010/2011 Laurea Magistrale inCHIMICA Analisi degli alimenti (LMC 7: ANALISI VARIE) Giorgio Bonaga

2. ANALISI DEI PRODOTTI DELL’ALVEAREI prodotti dell’alveare hanno composizione chimica molto differente: 1. Il miele è costituito quasi esclusivamente da zuccheri e acqua, con quantità modeste di proteine e grassi.nnnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn..2. La gelatina reale (“Royal Jelly”) ha una composizione di nutrienti (proteine, lipidi, zuccheri prevalentemente monosaccaridi) quasi ideale rispetto le indicazioni fornite dalla nutrizionistica contemporanea. Ooooooo oooo3.La propoli è costituita principalmente da resine e cere, ma è ricca anche di flavonoidi (le sostanze fenoliche che le conferiscono attività antisettica e antinfiammatoria) e oli essenziali (attività emolliente). 4.La cera è costituita principalmente da esteri carbossilici, idrocarburi e alcoli liberi .

3. MIELE • acqua: 17-20% • residuo secco: • proteine: 1-2% • lipidi: 0,5-1% • zuccheri (fruttosio, glucosio, saccarosio): 70-80% • sali minerali • vitamine (tracce) • aromi (tracce) • GELATINA REALE • acqua: 65% • residuo secco: • proteine: 20-40% • lipidi (FFA + lipidi neutri): 8-14% • zuccheri (fruttosio, glucosio, maltosio, saccarosio): 20-50% • sali minerali • vitamine (tracce)

4. PROPOLI • acqua: 1% • residuo secco: • resine e balsami: 50-55% • cere: 25-35% • flavonoidi: 5% • oli essenziali : 0,5% • sali minerali • vitamine (tracce) • CERA • acqua: 1-2% • residuo secco: • esteri carbossilici: 65-70% • esteri sterolici: 1% • idrocarburi: 10-15% • alcoli liberi: 10-12% • sali minerali (tracce)

5. MIELEAMMINOACIDI LIBERI Gi amminoacidi liberi (FAA) nel miele derivano dalle reazioni enzimatiche a carico della frazione proteica. La loro quantità più variare da 50 a 200 mg/100 g di prodotto. La determinazione della composizione quali-quantitativa degli amminoacidi liberi e la elaborazione statistica dei dati (“Student t Test”) può contribuire a prevedere l’origine floreale, la provenienza geografica e l’autenticità del prodotto ? Sono stati estratti, purificati e derivatizzati gli amminoacidi liberi di 6 campioni di miele monoflorale (acacia, castagno, limone, rododendro, lime e rosmarino). Nonostante le differenze tra i diversi mieli siano anche significative, il metodo non è in grado di individuare un singolo amminoacido o un gruppo di amminoacidi che consentano di differenziare l’origine botanica e/o la provenienza geografica del miele uniflorale. ……… La Fig. 1 riporta il tracciato GC degli amminoacidi liberi di miele di rosmarino.

6. Pro Nor Phe Glu Asp Lys Met Gly Ala Val Leu Ile Thr Ser Tyr 0 10 20 30 min Fig. 1 - Analisi GC degli amminoacidi liberi del miele di rosmarino. COLONNA: silice fusa, 30 m x 0,32 mm i.d., SPB 0,20 m TEMPERTAURA: da 80 (2’) a 280°C (10’), 5°C min. CARRIER GAS (He): 2, 8 ml/min.

7. MIELESOSTANZE VOLATILI Le sostanze volatili del miele contribuiscono in modo significativo al suo aroma, ma possono essere anche rappresentare una via alternativa per stabilirne l’origine botanica. .La classificazione dei mieli viene fatta sulla base dell’analisi pollinica (analisi melissopalinologica), un’analisi meccanica che individua e conta i grani di polline appartenenti alle diverse specie botaniche. L’analisi pollinica è un metodo che ha grandi limiti se si pensa, ad esempio, che il miele di importazione da paesi lontani (Messico, Argentina, ecc.) viene sovente raffinato a causa della fermentazione degli zuccheri e dopo la filtrazione finale viene aggiunto di polline pregiato (acacia, arancio, corbezzolo, ecc.) per poter dichiarare una qualità di più elevato valore commerciale. Si è tentato allora di caratterizzare il miele uniflorale sulla base del suo “aromatogramma”, in modo da individuare alcune sostanze volatili capaci di rappresentare dei “marker” della specie vegetale dichiarata. La frazione volatile è stata ottenuta con un apparecchio di distillazione/estrazione (Likens e Nickerson).

8. Estrattore di Likens-Nickerson(SDE = Simultaneous Distillation Extraction) Nel caso del miele di castagno sono state individuate circa 50 sostanze, delle quali 10 sembrano essere dei markers del miele di castagno e tra le quali svolge un ruolo preminente il 3-amminoacetofenone, una sostanza individuata per la prima volta in un prodotto naturale. Tra le sostanze individuate per MS, il limonene (il cui aroma è risultato antagonista con gli altri composti volatili) è in realtà il suo isomero ottico bornene. Il tracciato GC è riportato nella Fig. 2.

9. 100 TIC 50 0 0 10 20 min Fig. 2 – TIC della GC-MS dei componenti volatili del miele di castagno. COLONNA: silice fusa, WCOT 25 m x 0,2 mm i.d., OV 101 0,15 m TEMPERATURA: da 50 a 250°C, 5°C min CARRIER GAS (He): 2,0 ml/min.

10. GELATINA REALECARBOIDRATI Il dosaggio degli zuccheri semplici (glucosio, fruttosio e saccarosio) della gelatina reale (pappa reale) fornisce informazioni anche su altri costituenti neutri che, sebbene siano presenti in tracce, sono caratteristici della gelatina reale e possono essere lo strumento per stabilire la genuinità del prodotto.Inoltre, la possibilità di rivelare dei frammenti contenenti fino ad un massimo di quattro molecole di zuccheri condensate (tetrasaccaridi) consente di identificare le gelatine reali ottenute da zuccheri derivanti da amido idrolizzato o da isomerizzazione di sciroppi di fruttosio. Dopo estrazione, purificazione e derivatizzazione (TMS) i campioni sono stati analizzati con colonne capillari corte (10 metri), come mostra la Fig. 3.

11. 4 3 2 fruttosio -glucosio -glucosio saccarosio E eprodotti d’idrolisi e fruttosio -glucosio -glucosio Saccarosio R T prodotti d’idrolisi 7 5 7 1 6 pentosi esosi TRISACCARIDI DISACCARIDI MONOSACCARIDI min 35 0 Fig. 3 - Analisi GC dei componenti neutri di Royal Jelly. COLONNA: vetro 10 m x 0,32 mm i.d., SE 52 0,10-0,15 m TEMPERATURA: da 30 a 350°C, 11°C min. CARRIER GAS (He): 2,5 ml/min.

12. FORMAGGIOAMMINOACIDI LIBERI (Montasio) Gli amminoacidi liberi (FAA) hanno origine dalla degradazione della caseina ad opera degli enzimi del latte, del caglio, del siero innesto ed è una modificazione influenzata dai parametri tecnologici ed ambientali. Incidendo sul sapore e sull’aroma del formaggio gli amminoacidi liberi possono concorrere alla caratterizzazione dei prodotti, ma essere anche indicatori del loro stato di conservazione. L’impiego della HPLC ha dato ottimi risultati per l’ottima separazione dei picchi e l’elevata sensibilità analitica, ma è una tecnica che ha costi elevati ed impiega apparecchiature piuttosto costose, per cui si è tentato di ottenere una buona performance anche con la GC.

13. Dopo estrazione (EtOH 95%/HCl 1N = 75/25), purificazione su resina a scambio cationico (Dowex 50 W, 100-200 mesh) e derivatizzazione ( anidride n-eptafluorobutirrica), gli amminoacidi liberi sono stati analizzati con colonne GC capillari, come mostra la Fig. 4. La grande variabilità della composizione degli amminoacidi liberi di campioni di formaggio Montasio provenienti da numerosi caseifici della zona tipica di produzione è un dato non positivo dal momento che rivela la mancanza di una tipologia costante da valorizzare (formaggio tipico o formaggio di origine controllata) ed anche, per il ruolo rilevante che gli amminoacidi liberi svolgono sul flavor del formaggio, per l’eccessiva variabilità delle stesse caratteristiche sensoriali del prodotto la cui costanza sembra essere, viceversa, una caratteristica di ciascun caseificio. È stata anche analizzata la variazione della composizione degli amminoacidi liberi durante il periodo di stagionatura del formaggio, proprio per individuare la correlazione tra durata della stagionatura e le caratteristiche sensoriali del formaggio. Le variazioni del profilo degli amminoacidi liberi durante la stagionatura (40, 60, 80, 180, 240, 360 giorni) del formaggio Montasio sono mostrati nella Fig. 5.

14. alanina acido -amminobutirrico glicina valina treonina isoleucina leucina serina prolina acido -amminobutirrico idrossiprolina metionina acido aspartico aspargina fenilalanina acido glutammico glutammina tirosina ornitina lisina Fig. 4 - Analisi GC degli amminoacidi liberi del formaggio. COLONNA: silice fusa 25 m x 0,32 mm i.d., OV 1701 0,20 m TEMPERTAURA: da 80 a 280°C, 8°C min. CARRIER GAS (He): 1,6 ml/min.

15. 40 gg D-Ala Ala Val Gly Thr Ile Leu Pro Ser Gaba Met Asp D-Phe Phe D-Glx Glx Tyr Orn Lys 180 gg 60 gg 240 gg 8 12 16 80 gg 360 gg 14 7 10 I.S. 3 18 19 5 4 2 11 9 17 1 15 13 6 Fig. 5 - Analisi GC della variazione degli amminoacidi liberi del formaggio. COLONNA: silice fusa 25 m x 0,32 mm i.d., Chirasil-L-Val 0,20 m TEMPERATURA: da 80 a 280°C, 8°C min. CARRIER GAS (He): 1,6 ml/min.

16. Parmigiano Reggiano Grana Padano Latteria Ricotta Mozzarella Formaggio fuso Montasio Stracchino Gorgonzola FORMAGGIOAMMINE BIOGENICHE In alcuni prodotti alimentari fermentati a base proteica, tra cui i formaggi, si possono formare quantità significative di ammine biogeniche per effetto dei processi di decarbossilazione enzimatica di particolari amminoacidi. Scamorza Provolone Sottiletta Taleggio Pecorino

17. Le ammine biogeniche sono sostanze indesiderate a spiccata azione neuro- e vaso-attiva che, a certe concentrazioni, compromettono seriamente la sicurezza dell’alimento da un punto di vista tossicologico. La dose di ammine biogeniche che produce effetti tossici varia da individuo a individuo, in relazione all’attività detossificante del fegato tra cui spicca l’azione della monoamminossidasi (MAO) che converte le ammine in aldeidi. lisina cadaverina O - N H C O 2 2 H N O H H N 2 2 H H N 2 ornitina putrescina istidina istammina tirosina tirammina

18. Le ammine biogeniche presenti in maggiore quantità sono la tirammina (Gorgonzola, Asiago, Montasio) e l’istidina (Gorgonzola, Asiago, Parmigiano Reggiano) seguite, in ordine decrescente, dalla cadaverina, putrescina, triptofano e 2-feniletilammina, ma con alcune variazioni di concentrazione nei diversi formaggi analizzati. La Fig. 6 riporta un esempio di analisi HPLC. Fig. 6 - Analisi HPLC di ammine biogeniche di formaggio Gorgonzola triptofano 2-feniletilammina putrescina cadaverina istammina istidina tirammina COLONNA: 150 mm x 4,6 mm i.d., Spherisorb 3S TG 3 FASE MOBILE: A) CH3CN B) H2O C) tampone fosfato 0,01 M a pH 7.GRADIENTE: 0,8 ml/minDETECTOR: UVB a 254 nm

19. VINOANALISI DEGLI ACIDI LIBERI Il dosaggio degli acidi organici è un’analisi tradizionale perché queste sostanze sono responsabili del gusto del vino. La Fig. 7 riporta il cromatogramma degli acidi organici di un vino rosso. acido tartarico acido malico glucosio fruttosio acido succinico acido lattico glicerina acido acetico etanolo Fig. 7 - Analisi HPLC degli acidi organici di un vino rosso. COLUMN: 300 mm x 7,7 mm i.d., PL Hi-Plex H 8 mm FASE MOBILE:H2SO40,004 M con eluizione isocratica VELOCITA’ DI FLUSSO: 0,4 ml/min DETECTOR: RID

20. VINODOSAGGIO DI LISOZIMA • L’attività enzimatica del lisozima determina la rottura della membrana cellulare dei batteri gram+ (es.: lattobacilli). La proteina viene utilizzata come efficace coadiuvante tecnologico alternativo alle tecniche tradizionali (freddo, SO2, filtrazione) per la gestione microbiologica di mosti e vini, dalla fermentazione allo stoccaggio fino all’imbottigliamento. Il lisozima è una preparazione enzimatica pura in forma granulare, ottenuta dall’albume dell’uovo che consente: • di prevenire gli spunti lattici e la “fermentazione malo-lattica”; • di agevolare la fermentazione alcolica riducendo l’effetto antagonista dei batteri lattici sui lieviti, sui quali non esercita alcun effetto di inibizione; • di ridurre i quantitativi di SO2. Il dosaggio viene fatto per HPLC, confrontando la risposta UVD con quella FLD, come mostra la Fig. 8. lisozima

21. Fig. 8 – Analisi HPLC di lisozima nel vino. COLONNA: 75 mm x 4,6 mm i.d., TSK-C18 5mm FASE MOBILE: ACN:TFA:H2O con eluizione a gradiente DETECTOR: A. UVD a 280 nm B. UVD a 225 nm C. FLD: lex= 276 nm, lem = 345 nm

22. VINODETERMINAZIONE DEI PAHs NEI TRUCIOLI DI QUERCIA IMPIEGATI IN ENOLOGIA I vini, gli aceti e i distillati in genere vengono sempre più diffusamente invecchiati in contenitori di legno (abitualmente quercia). I prodotti invecchiati si distinguono per un incremento della loro complessità sensoriale dovuta al trasferimento di sostanze aromatiche e fenoliche dal legno alla bevanda e all’evoluzione della frazione fenolica (inclusa la stabilizzazione del colore) ad opera dell’ossigeno. Queste caratteristiche sono molto apprezzate dai consumatori e pertanto i prodotti legnosi per l’invecchiamento sono classificati tra i coadiuvanti tecnologici (sostanze che assistono e favoriscono le modificazioni dovute ai diversi processi di trasformazione). L’uso dei trucioli di legno (woody chips) è un’alternativa abbastanza recente (fine anni ‘90) all’invecchiamento delle bevande alcoliche in barilotti, barili, botti, ecc., perché oltre all’incremento di superficie di scambio i trucioli sono molto vantaggiosi da un punto di vista economico, anche se solo di recente sono stati ammessi dalla normativa UE (2006).

23. Mentre il legno dei barili, barilotti, botti, ecc. viene seccato all’aperto per 1-3 anni (al sole, vento, pioggia e neve) allo scopo di favorire l’evoluzione chimica dei tannini e della cellulosa, per poi essere “tostato” direttamente in pile, i trucioli di legno vengono seccati in forni elettrici o a raggi infrarossi. A causa dell’attività mutagena e cancerogena degli idrocarburi aromatici policiclici, è importante che i trucioli di legno non cedano PAHs alla bevanda sottoposta all’invecchiamento. L’estrazione solido/liquido è stata fatta con Soxhlet, lasciando i trucioli di legno in immersione in diclorometano all’ebollizione. L’analisi HPLC dell’estratto è riportata in Fig. 9. woody chips soxhlet

24. Fig. 9 - Analisi HPLC di PAHs dell’estratto di trucioli di quercia (A) e standard (B).COLONNA: 150 mm x 4,6 mm i.d., Supelcosil LC PAH 0,5 mm.FASE MOBILE:H2O e ACNGRADIENTE: 40% ACN (isocratica 5’) fino al 100% ACN (30’). VELOCITA’ FLUSSO: 1,5 ml/min

25. CONTENUTO DI PAHs (ng/g legno) nei trucioli di quercia Nonostante l’estrazione con il Soxhlet sia molto più “hard” rispetto quella delle bevande alcoliche (nonostante il maggior tempo di contatto), i livelli di PAHs sono contenuti nei limiti imposti dalla legislazione europea (relativamente alle “acque potabili”, dal momento che non sono stati ancora fissati i limiti di legge per le bevande alcoliche). D[a,h]F

26. naphtalene acenaphtylene phenantrene anthracene NAP ACN PHE ANT fluoranthene pyrene benz[a]anthracene crysene FLA PYR B[a]A CHR benz[b]fluotanthene benz[k]fluoranthene benz[a]pyrene B[b]F B[k]F B[a]P dibenz[a,h]fluoranthene benz[g,h,i]perylene indeno[1,2,3]pyrene D[a,h]F B[g,h,i]P I[1,2,3]P

27. VINOIDENTIFICAZIONE DI COMPOSTI VOLATILINEI TRUCIOLI DI QUERCIA Il legno di quercia tostato per l’invecchiamento dei vini produce un numero rilevante di composti volatili e odorosi. La loro determinazione è preceduta da una estrazione con sistema ASE 200 (“accelerated solvent extraction”). L’analisi GC-MS degli estratti di trucioli sottoposti o no a tostatura ha consentito di individuare numerose sostanze volatili (guaiacolo e derivati, siringolo e derivati, vanillina e derivati, eugenolo e derivati, composti furanici, furanoni, piranoni, lattoni, fenoli, ecc.), ma la composizione quali-quantitativa degli estratti dipende dalla natura del materiale di partenza e dagli effetti dovuti al processo di tostatura. Sono stati anche identificati, per la prima volta, tre nuovi composti volatili: 3-idrossimaltolo,2,5-furandicarbaldeide e furilidrossimetilchetone, la cui presenza può essere fatta derivare dalla pirolisi degli zuccheri o dalle reazioni di Maillard.

28. Fig. 10 – Analisi GC/MS delle sostanze volatili in trucioli (A) non tostati e (B) tostati. COLONNA: silice fusa 30 m x 0,25 mm, Stabilwax 0,25 m. TEMPERATURA: da 40 a 100°C, 3°C/min e da 100 a 240°C(10 min.), 5°C/min.CARRIER GAS (He): 1,0 ml/min DETECTOR: MS (EI, 70 eV)

29. Classi di sostanze volatili nell’estratto di trucioli di quercia guaiacolo 2-metossi-fenolo eugenolo 2-metossi-4-(propen-2-il)-fenolo vanillina 4-idrossi-3-metossi-benzaldeide siringolo 2,6-dimetossi-fenolo

30. OLI ESSENZIALI Le sostanze responsabili dell’aroma di molti frutti, specialmente agrumi, sono di natura terpenica e vengono abitualmente estratti dalle matrici vegetali per distillazione in corrente di vapore. Le frazioni oleose dei distillati, note come “oli essenziali”, vengono utilizzate come aromatizzanti nella produzione di prodotti cosmetici (detergenti, profumi, deodoranti, ecc.), ma sul loro impiego si basa la “aromaterapia”. Secondo questa pratica (empirica) alcuni oli essenziali sono antisettici, altri cicatrizzanti, antireumatici e antinevralgici (rosmarino, camomilla), tonificanti (abete, cipresso, geranio, basilico, rosmarino), stimolanti (patchouly, timo), antispasmodici (cipresso, lavanda, basilico, arancio), perfino dotati di attività antiparassitaria (arancio, eucaliptus, lavanda, cedro, cipresso, geranio, timo).. La composizione di un olio essenziale è molto complessa, perché sovente sono presenti anche numerosi prodotti di ossidazione dei componenti terpenici, ma è fondamentale per stabilire la congruità dell’estratto rispetto la sua destinazione d’uso. Specialmente la Fast GC e l’Ultrafast GC hanno risolto molti problemi analitici nel settore degli oli essenziali.

31. DISTILLATO DI OLIO DI LIME • a-pinene • camphene • b-pinene • myrcene • a-phellandrene • 1,4-cineolo • a-terpinene • p-cymene • d-limonene • g-terpinene • terpinolene • linalool • a-fencylalcohol • terpinen-1-ol • b-terpineol • borneol • terpinen-4-ol • b-terpineol • g-terpineol • decanal • neral • geranial • neralacetate • geranylacetate • dodecanal • b-carophyllene • trans-a-bergamotene • trans-a-farnesene • b-bisabolene Fig. 11 – Analisi Ultrafast GC del distillato di olio di lime. COLONNA: silice fusa 15 m x 0,10 mm, Equity-1 0,10 m. TEMPERATURA: da 70°C (1’) a 250°C (1’), 35°C/min. CARRIER GAS (H2): 45 cm/sec DETECTOR: FID

32. OLIO ESSENZIALE DI LIMONE 1. a-thujene 26. terpinen-4-ol • 2. a-pinene 27. a-terpineol • 3. camphene 28. decanal • 4. sabinene 29. citronellol • 5. b-pinene 30. nerol • 6. myrcene 31. neral • 7. octanal 32. carvone • 8. a-phellandrene 33. geraniol • 9. d-3-carene 34. geranial • 10. a-terpinene 35. perilla aldehyde • 11. p-cymene 36. undecanal • 12. limonene 37. methyl geranoate • 13. b-ocimene 38. citronellyl acetate • 14. g-terpinene 39. neryl acetate • 15. cis-sabinene hydrate 40. linalyl isobutanoate • 16. octanol 41. geranyl acetate • 17. terpinolene 42. 1-tetradecene • 18. linalool 43. tetradecane • 19. nonanal 44. (E)-caryophyllene • 20.cis-limonene oxide 45.trans-a-bergamotene • 21.trans-limonene oxide 46. b-bisabolene • 22. (E)-myroxide 47. (E)-g-bisabolene • 23. canphor 48. norbornanol • 24. citronellal 49. canpherenol • 25. borneol 50.a-bisabolol Fig. 12 – Analisi Ultrafast GC di olio essenziale di limone. COLONNA: silice fusa 10 m x 0,10 mm i.d., SLB-5ms 0,10 m. TEMPERATURA: da 40°C a 320°C, 50°C/min. CARRIER GAS (H2): 82 cm/sec DETECTOR: FID

33. Cannabis sativaCOMPOSIZIONE CHIMICA In Italia la coltivazione industriale della Cannabis sativa è consentita – dopo concessione di un permesso speciale - soltanto per l’ottenimento della fibra, ovvero impiegando varietà selezionate (e certificate) di canapa a basso contenuto di tetraidrocannabinolo (THC), l’unico costituente psicoattivo. La legge Fini-Giovanardi (L. 49/2006) stabilisce che la coltivazione non autorizzata di canapa è punibile da 6 a 20 anni di reclusione o da 1 a 6 anni se il giudice valuta il reato di lieve entità. SI NO

34. CLASSIFICAZIONE BOTANICA • Small e Cronquist • var. sativa • ssp. sativa • var. spontanea Vavilov • Cannabis sp. sativa L. • var. indica • ssp. indica • var. kafiristanica Vavilov • Shultes: • Cannabis sp. sativa (canapa utile) • Cannabis sp. indica (canapa indiana) • Cannabis sp. ruderalis (canapa ruderale) • Clarke e Watson (2002): • Cannabis sp.sativa(tutte le sottospecie e varietà) • Cannabis sp. indica (solo le varietà usate per produrre hashish e marijuana in Afghanistan e Pakistan). Cannabis

35. Cannabis CLASSIFICAZIONE CHIMICA CBN+THC/CBD var. sativa > 2ssp. sativa var. spontanea Vavilov< 2 Cannabis sativa var. indica > 20 ssp. indica var. kafiristanica Vavilov > 50

36. 9

37. A+B = THC + exCBDA A = THC-Met X = CBDA-Met 4 = THC-Met-TMS 2 = CBDA-Met-diTMS A+B A+B 5 5 tal quale tal quale A X A 5 5 CH2N2 CH2N2 X 4 5 2 2 4 CH2N2 + TMS CH2N2 + TMS 5 3 1 SE 52 OV 1701

38. 299 M + 314 THCmol wt 314(peak A) 371 M + 386 315 THC-TMSmol wt 386(peak 4)

39. 361 429 M + 250 THCA-Met-TMSmol wt 444 444

40. M + 372 CBDA-Metmol wt 372(peak X) 429 357 341 CBDA-Met-diTMSmol wt 514 (peak 2) M + 514

41. SCHEMA DI CONVERSIONE DEL CBDA IN THC CBDA CBDA-CH3

42. CONCLUSIONI SUL THC Se alla temperatura dell’injector (320°C) il CBDA prima ciclizza (l’acidità del mezzo sembra essere la condizione imprescindibile), poi si decarbossila, con il risultato netto che si converte in THC (il principio psicoattivo), a maggior ragione, tenendo conto che la temperatura di combustione dello “spinello” nella brace è di 800-880°C e che nella zona distale rispetto la brace la temperatura non è inferiore a 350°C, è “inevitabile” la conversione del CBDA in THC. In ambiente acido, anche il CBD può ciclizzare a THC ?