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REPLICAÇÃO DE DNA

Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. REPLICAÇÃO DE DNA. Conteúdo. Replicação do DNA e ciclo celular; Origem de Replicação; Mecanismos básicos de replicação Fases da replicação *Início *Alongamento *Término.

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REPLICAÇÃO DE DNA

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Presentation Transcript

  1. Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia REPLICAÇÃO DE DNA

  2. Conteúdo... • Replicação do DNA e ciclo celular; • Origem de Replicação; • Mecanismos básicos de replicação • Fases da replicação • *Início • *Alongamento • *Término

  3. GENÉTICA BACTERIANA • O DNA bacteriano é circular; • O cromossomo de E. coli, por exemplo, contém cerca de 4 milhões de pares de bases e é aproximadamente 1000 vezes mais longo que a célula.

  4. Estrutura espacial da dupla hélice Estruturadaduplahélice 1953: Watson and Crick

  5. Replicação do DNA

  6. Replicação DNA DNA Trasncrição Reversa Transcrição RNA Tradução Proteína

  7. Replicação do DNA x Ciclo Celular 1 Escherichiacoli 2 TEMPO DE GERAÇÃO: 20 MINUTOS 3 4

  8. Replicação do DNA x Ciclo Celular “O ciclo de replicação e início da formação do septo ocorrem bem antes do processo de divisão”

  9. Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação • Metilação – DNA hemi-metilado- Ligação física com a membrana- Garante que a origem será ativada uma vez por ciclo

  10. Replicação do DNA x Ciclo Celular

  11. Replicação do DNA x Ciclo Celular Eucariotos

  12. INÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEM • Região do DNA onde a replicação começa • Origens de procariotos e eucariotos – ricas em AT • Procariotos, plasmídeos e vírus - uma origem • Eucariotos – várias origens • E. coli – região de 245 pb essencial à replicação • 4 seqüências de 9 pb - TTAT(C/A)CA(C/A)A • 3 seqüências de 13 pb ricas em AT

  13. OriC do cromossomo de E.coli

  14. Processo de início da replicação 52 kDa 1- Complexo inicial autocooperação

  15. 2- Complexo aberto 3- Complexo pré-priming HU e IHF DnaB - helicase

  16. Proteínas presentes na origem de replicação de E. coli

  17. Regras básicas do processo de replicação • Processo semiconservativo • Início da replicação - Origem • Movimento da forquilha de replicação • Unidirecional ou bidirecional • Direção da replicação • 5’  3’ • Semi-descontinuidade da replicação • O processo pode ser dividida em: - Inicio da replicação - Forquilha de replicação - Terminação

  18. A replicação do DNA é semi-conservativa?

  19. A replicação do DNA é semi-conservativa Cultivo em meio 15NH4Cl Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958 Cultivo em meio 14NH4Cl Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl

  20. Replicação do DNA Semi-conservativa

  21. INÍCIO DA REPLICAÇÃO Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação • Origem + Término • Durante um ciclo celular, a origem de replicação pode ser ativada mais de uma vez em procariotos e uma vez em eucariotos • O cromossomo de uma célula procariótica constituem um único replicon • Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons

  22. A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado

  23. O genoma bacteriano circular constitue um único replicon • A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min • Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

  24. O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6 h em uma célula somática

  25. MOVIMENTO DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Unidirecional ou bidirecional A replicação é bidirecional em procariotos A replicação é unidirecional em eucariotos

  26. DIREÇÃO DA REPLICAÇÃO A adição dos nucleotídeos para o alongamento da cadeia é SEMPRE no sentido 5’-3’

  27. SEMI-DESCONTINUIDADE DA REPLICAÇÃO A replicação ocorre de maneira contínua em uma das fitas e descontínua na outra fita

  28. Replicação do DNA • Procariotos • Genes menores • Cromossomo circular • Bidirecional • UMA ORIGEM • Eucariotos - Genes e cromossomos maiores • Unidirecional • VÁRIAS ORIGENS

  29. ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA • Helicases (DnaB) • DNA Polimerase • Primase • SSB (Single Strand Binding Protein) • Topoisomerases • DNA ligase

  30. PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI

  31. DNA POLIMERASES E PRIMASES

  32. As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

  33. Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação

  34. DNA POLIMERASES E. coli - DNA Polimerase I # polipeptídeo de 928 aa, replicação e reparo de DNA

  35. Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização 5’  3’ + + + Exonuclease 3’  5’ + + + Exonuclease 5’  3’ + - - Número de subunidades 1 4 10 Tamanho em kDa 103 90 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000

  36. DNA POLIMERASES • Eucariotos - DNA polimerases  - primase  e  - reparo do DNA  - replicação do genoma nuclear  - replicação do DNA mitocondrial • Bacteriófagos - T4 DNA Polimerase • Outras - Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) Pfu DNA polimerase(Pyrococcus furiosus)

  37. TAQ DNA POLIMERASE Thermusaquaticus -Estável a temperaturas de 177 graus; Temperatura Ótima: 72 graus

  38. Forquilha de Replicação

  39. Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua REPLICAÇÃO DO DNA A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA

  40. REPLICAÇÃO DO DNA Fita contínua (líder) Fita descontínua Fragmentos de Okazaki: 1000 a 2000 nt (PROCARIOTOS) 100 a 200 nt (EUCARIOTOS)

  41. Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua • A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA • A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas • A DNA ligase sela as quebras

  42. Síntese das fitas contínua e descontínua é independente

  43. REPLICAÇÃO DO DNA A DNA ligase sela as quebras

  44. REPLICAÇÃO DO DNA O complexo de replicação • A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha • Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas • O primossomo afasta uma das fitas molde • Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

  45. Da origem ao término da replicação

  46. Término da replicação- genomas lineares Problema!!! REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR: o modelo demonstra o surgimento de extremidades não pareadas após a remoção dos primers no final da replicação

  47. Término da Replicação • Formação de Concatâmeros

  48. Término da replicação • Telômeros

  49. Retrovírus

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