REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI MULTICELLULARI

1. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI MULTICELLULARI • LIVELLI DI CONTROLLO • MECCANISMI EPIGENETICI • CROMOSOMI POLITENICI: PUFFING • CROMOSOMI A SPAZZOLA • INATTIVAZIONE FUNZIONALE DEL CROMOSOMA X NEI MAMMIFERI • IPER-ESPRESSIONE DEI GENI LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA X NEI MASCHI DI Drosophila melanogaster • IMPRINTING GENOMICO

2. LIVELLI DI CONTROLLO SEQUENZE REGOLATRICI DNA MODIFICAZIONI EPIGENETICHE CONROLLO TRASCRIZIONE NUCLEO TRASCRITTO PRIMARIO MODIFICAZIONI TRASCRITTI CONTROLLO MATURAZIONE SITI DI SPLICING ATTIVITA’ EMZIMI CONROLLO TRASPORTO CONTROLLO DELLA STABILITA’ DEI MESSAGGERI mRNA CITOPLASMA CONROLLO TRADUZIONE RNA INATTIVO PROTEINA

3. PROCESSO DI SCELTA CHE CARATTERIZZA LE VIE DI SVILUPPO REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DI UNA PROTEINA

4. DEFINIZIONI • ETEROCROMATINA • REGIONI DEL CROMOSOMA EUCARIOTICO DENSE E COMPATTE IN TELOFASE INTERFASE E PRIMA PROFASE • PIU’ INTENSAMENTE COLORATE IN TUTTE LE FASI DEL CICLO CELLULARE • ALLOCICLICHE • RITENUTE IN LARGA MISURA GENETICAMENTE INERTI • EUCROMATINA • REGIONI DEL CROMOSOMA EUCARIOTICO CHE SUBISCONO IL NORMALE CICLO DI CONDENSAZIONE • A COLORAZIONE PALLIDA IN TUTTE LE FASI DEL CICLO • SI PENSA CHE CONTENGANO I GENI FUNZIONALMENTE ATTIVI

5. DEFINIZIONI • ETEROCROMATINA COSTITUTIVA • REGIONI SPECIFICHE DI ETEROCROMATINA • PRESENTI SU AMBEDUE GLI OMOLOGHI • IN TUTTI I TIPI CELLULARI • IN TUTTI GLI STADI DELLO SVILUPPO • ETEROCROMATINA FACOLTATIVA • PORZIONI DI ETEROCROMATINA LOCALIZZATE IN REGIONI CROMOSOMICHE CHE NORMALMENTE SONO EUCROMATICHE : • IN ALTRE CELLULE OPPURE • IN ALTRI INDIVIDUI DELLA STESSA SPECIE OPPURE • SULL’ALTRO OMOLOGO • E.S.: CROMOSOMI PATERNI NEI MASCHI DI ALCUNE SPECIE DI INSETTI, CROMOSOMA X INATTIVO NELLE FEMMINE DEI MAMMIFERI)

6. COMPENSAZIONE DI DOSE GENICA • NELLE SPECIE CON CROMOSOMI DEL SESSO ETEROMORFI, IN PARTICOLARE NELLE SPECIE A DETERMINAZIONE CROMOSOMICA DEL SESSO DI TIPO XX/XY, TUTTI I GENI LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA X SONO IN DOPPIA DOSE NELLE FEMMINE. • MOLTI DEI GENI LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA X SONO HOUSE-KEEPING. • IL CROMOSOMA Y E’ IN GENERALE PREVALENTEMENTE ETEROCROMA-TICO E CONTIENE GENI LEGATI ALLO SVILUPPO DEI CARATTERI SESSUALI SECONDARI ED ALLA FERTILITA’

7. LE CELLULE SOMATICHE MASCHILI E FEMMINILI SONO FONDAMENTAL-MENTE UGUALI • CI DEVE ESSERE UN MECCANISMO DI REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA CHE FACCIA IN MODO CHE LA DOSE DEL PRODOTTO DI TUTTI I GENI LEGATI ALL’X SIA UGUALE NEI MASCHI E NELLE FEMMINE ANCHE SE NELLE FEMMINE IL NUMERO DI COPIE DEGLI STESSI GENI E’ DOPPIO. COMPENSAZIONE DEL DOSAGGIO DEI GENI LEGATI ALL’X

8. MECCANISMI DI COMPENSAZIONE SPECIE DIVERSE HANNO SVILUPPATO DIVERSI MECCANISMI DI COMPENSAZIONE DEL DOSAGGIO DEI GENI LEGATI ALL’X REGOLAZIONE EPIGENETICA DELL’ESPRESSIONE GENICA BASATA SU MODIFICAZIONI DELLA STRUTTURA DELLA CROMATINA E NON SU CAMBIAMENTI NELLA SEQUENZA DEL DNA

9. MECCANISMI DI COMPENSAZIONE MAMMIFERI INATTIVAZIONE FUNZIONALE DI UNO DEI CROMOSOMI X IN TUTTE LE CELLULE SOMATICHE FEMMINILI METILAZIONE CITOSINA DITTERI IPER-ESPRESSIONE DEI GENI LOCALIZZATI SUL CROMOSOMA X MASCHILE ACETILAZIONE ISTONE H3 CORRELAZIONE CON I MECCANISMI DI DETERMINAZIONE DEL SESSO

10. INATTIVAZIONE FUNZIONALE DEL CROMOSOMA • PRIME OSSERVAZIONI • OSSERVAZIONI CITOLOGICHE • OSSERVAZIONI GENETICHE • IPOTESI DI MARY LYON • PROVE CITOLOGICHE • STUDIO DI MARCATORI GENETICI • MECCANISMO MOLECOLARE

11. PRIME OSSERVAZIONI 1949 BARR IN NUCLEI INTERFASICI DI CELLULE SOMATICHE DI FEMMINE DI GATTO OSSERVA LA CROMATINA SESSUALE: CORPO ETEROCROMATICO, PIU’ INTENSAMENTE COLORATO RISPETTO AL RESTO DELLA ETEROCROMATINA, ASSOCIATO ALLA MEMBRANA NUCLEARE OSSERVAZIONI SUCCESSIVE NUCLEI INTERFASICI DI TUTTE LE CELLULE SOMATICHE DI FEMMINE DI MAMMIFERO NORMALI PRESENTANO UN CORPO DI BARR

12. REGOLA DELL’N-1 ANALISI DI ANOMALIE DEL CROMOSOMA X NELL’UOMO: CORRELAZIONE TRA IL NUMERO DI CORPI DI BARR ED IL NUMERO DI CROMOSOMI X ATTIVI IL NUMERO DI CORPI DI BARR E’ TALE DA MANTENERE ATTIVO UN SOLO CROMOSOMA X IN PRESENZA DI ANOMALIE STRUTTURALI DEL CROMOSOMA X VIENE PREFERENZIALMENTE INATTIVATO IL CROMOSOMA X RIARRANGIATO

13. 1950 RUSSEL • ANALISI FENOTIPICA DI FEMMINE DI TOPO • TRASLOCAZIONE DI GENI CHE DETERMINANO IL COLORE DEL MANTELLO SUL CROMOSOMA X • FENOTIPO DEL MANTELLO VARIEGATO IN FEMMINE CON L’ X TRASLOCATO

14. GATTI TARTARUGA FEMMINE DI TOPO ETEROZIGOTI • FEMMINE ETEROZIGOTI PER UN CARATTERE LEGATO ALL’X CHE DETERMINA IL COLORE DEL MANTELLO SONO A CHIAZZE • IL 50% DEI LORO FIGLI MASCHI SONO BIANCHI ED IL 50% NERI

15. IPOTESI DI MARY LYON: 1961 CARATTERI LEGATI AL SESSO MOSTRANO VARIEGAZIONE NELLE CELLULE SOMATICHE DELLE FEMMINE ETEROZIGOTI • LA COMPENSAZIONE DEL DOSAGGIO NEI MAMMIFERI AVVIENE ATTRAVERSO L’INATTIVAZIONE DI UNO DEI CROMOSOMI X PRESENTI NELLE FEMMINE • SI OTTIENE IN QUESTO MODO L’EQUIVALENZA FUNZIONALE DEI GENI POSTI SUL CROMOSOMA X NEI MASCHI E NELLE FEMMINE • PUO’ ESSERE INATTIVATO A CASO L’X MATERNO O QUELLO PATERNO (CI SONO ECCEZIONI ALL’INATTIVAZIONE CASUALE) • L’INATTIVAZIONE AVVIENE IN UNO STADIO PRECOCE DELLO SVILUPPO EMBRIONALE (5 gg NEL TOPO) • L’INATTIVAZIONE VIENE EREDITATA SOMATICAMENTE: LE CELLULE DERIVATE PER MITOSI DA UNA CELLULA CON INATTIVATO L’X MATERNO HANNO SEMPRE INATTIVATO L’X MATERNO; LE CELLULE DERIVATE PER MITOSI DA UNA CELLULA CON INATTIVATO L’X PATERNO HANNO SEMPRE INATTIVATO L’X PATERNO MEMORIA CELLULARE

16. EVIDENZE CITOLOGICHE • NUMERO DI CORPI DI BARR IN CARIOTIPI ANORMALI • REPLICAZIONE: IL CROMOSOMA X INATTIVO E’ L’ULTIMA REGIONE DEL GENOMA CHE SI REPLICA DURANTE LA FASE S (INACTIVE X iX = late X lX)

17. REPLICAZIONE DI iX-lX(inactive X-late X) INCORPORAZIONE DI TIMIDINA TRITIATA AUTORADIOGRAFIA INCORPORAZIONE DI BrdU BANDEGGI DINAMICI iX (lX) E’ UNIFORMEMENTE SCURO AL BANDEGGIO GBG iX (lX) E’ UNIFORMEMENTE CHIARO AL BANDEGGIO RBG

18. RELAZIONE TRA CARIOTIPOCROMATINA SESSUALENUMERO DI CROMOSOMI X A REPLICAZIONE TARDIVA COSTITUZIONE CORPI DI BARR CROMOSOMI X CROMOSOMICA A REPLICAZIONE TARDIVA 46, XX 1 1 46, XY 0 0 45, X0 0 0 47, XXY 1 1 48, XXYY 1 1 47, XXX 2 2 48, XXXY 2 2 49, XXXYY 2 2 48, XXXX 3 3 49,XXXXY 3 3 46, XXdel 1 piccolo Xdel 46, XiXq 1 grande iXq

19. STUDIO DI MARCATORI GENETICI • VARIANTI ELETTROFORETICHE DELLA G6PD NEL SIERO DI FEMMINE ETEROZIGOTI • DISPLASIA ECTODERMICA ANIDROTICA

20. MECCASNISMO DI INATTIVAZIONE • IL CROMOSOMA iX E’ ETEROCROMATICO, QUINDI IPERCONDENSATO (ETERO-CROMATINA FACOLTATIVA) • LA CONDENSAZIONE DELLA CROMATINA E’ SIMILE AD UN PROCESSO DI CRISTALLIZZA-ZIONE CHE INNESCANDOSI IN UN PUNTO DIFFONDE NEI DUE SENSI

21. MECCANISMO DI INATTIVAZIONE • INNESCO • DIFFUSIONE • MANTENIMENTO

22. MECCANISMO DI INATTIVAZIONE • ESISTE UN CENTRO DI INATTIVAZIONE SU iX (Xic) • A PARTIRE DA XIC -“CIS ACTING”- LA CONDENSAZIONE DELLA CROMATINA DIFFONDE NEI DUE SENSI • LA SEQUENZA XIC SULL’ iX RISPONDE AD UN SEGNALE IN TRANS CHE INNESCA L’INATTIVAZIONE • LA SEQUENZA XIC SULL’ aX E’ BLOCCATA, NON E’ ACCESSIBILE AL FATTORE “TRANS ACTING”

23. MECCANISMO DI INATTIVAZIONE • IDENTIFICAZIONE DEL CENTRO DI INATTIVAZIONE (STUDIO DI RIARRANGIA-MENTI DEL CROMOSOMA X INTRACROMOSOMICI INTERCROMOSOMICI) • RICERCA DI GENI CHE SFUGGONO ALL’INATTIVA-ZIONE: QUALI SEGNALI LI MANTENGONO ATTIVI? • RICERCA DI GENI ESPRESSI SOLO DA iX (XIST)

24. MECCANISMO DI INATTIVAZIONE XIC XIST/TSIX Xq13 ON XIST XIC Xi ON XIST XIC Xa OFF TSIX ???

25. XIST • GENE ISOLATO PER CASO DA GENOTECHE DI ESPRESSIONE DI IBRIDI SOMATICI CONTENENTI iX, CERCANDO cDNA OMOLOGHI ALLA STEROIDO SOLFATASI (gene localizzato inXpter che sfugge all’inattivazione) • LOCALIZZAZIONE: Xq13, COINCIDE CON XIC • ESPRESSO SOLO DA iX • E’ UN RNA NON TRADOTTO DI 10 Kb

26. Regione XIC Verde = trascritti non tradotti Counting = la cellula è in grado di conoscere il numero di X presenti e mantenerne solo uno attivo. Choice = la cellula sceglie un cromosoma X e lo mantiene attivo mentre inattiva l’altro (casuale) Xist = Xi specific transcript Tsix = RNA antisenso di Xist

27. Tsix regola l’espressione di Xist mediante: • INTERFERENZA • DEGRADAZIONE • MASCHERANDO UN SITO DI LEGAME • INIBENDO UN ENHANCER • SILENZIANDO ATTRAVERSO MODIFICAZIONE DELLA CROMATINA

28. MANTENIMENTO • METILAZIONE • MEMORIA CELLULARE

29. METILAZIONE DEL DNA “MEMORIA CELLULARE”

30. COMPENSAZIONE DI DOSE DI GENI LEGATI ALL’X IN Drosophila melanogaster • PRIME OSSERVAZIONI • STUDIO DI MARCATORI GENETICI • OSSERVAZIONI CITOLOGICHE • MECCANISMO MOLECOLARE

31. PRIME OSSERVAZIONI • ALLELI DIVERSI DEL LOCUS W POSSONO PRODURRE LO STESSO FENOTIPO NEI MASCHI ED IN FEMMINE ETEROZIGOTI: ALCUNI SONO COMPENSATI ALTRI NO • LA DELEZIONE NOTCH PRODUCE FEMMINE CON ALI INCISE: ENTRAMBI I CROMOSOMI X FUNZIONANO • COSTRUITI CEPPI CON DIVERSO NUMERO DI ALLELI ma-l (x-linked) E ry (autosomico) • FEMMINE ETEROZIGOTI PER6-FOSFOGLUCONATODEIDROGENASI MOSTRANO UNA BANDA IBRIDA • NELLE TRASLOCAZIONI X;A I LOCI LOCALIZZATI SULL’X RESTANO COMPENSATI, QUELLI AUTOSOMICI NO

32. SEMBRA CHE OGNI LOCUS SI COMPORTI IN MODO INDIPENDENTE • OGNI LOCUS HA L’INFORMAZIONE DEL NUMERO TOTALE DI COPIE DEL GENE E CONTROLLA DI CONSEGUENZA LA PROPRIA ATTIVITA’ • A DIFFERENZA DI QUANTO ACCADE NEI MAMMIFERI C’E’ RELAZIONE TRA NUMERO DI COPIE DEI GENI LEGATI ALL’X, NUMERO DI COPIE DI LOCI AUTOSOMICI ED ESPRESSIONE GENICA

33. MARCATORI GENETICI 1931, MULLER: LOCUS WHITE ALLELE Wa GENOTIPO PIGMENTO Wa/ Wa ++ Wa/ y++ Wa/ Wa du +++ Wa/ Wa del++ Wa dup/ y++++ + + +

34. MARCATORI GENETICI 1964, YOUNG: 6-FOSFOGLUCONATODEIDROGENASI 6-PGD NUMERO ATTIVITA’ DI GENI ENZIMATICA 2 4.66 1 4.65 1 2.81 2 6.26 + + ALTRI ESEMPI: TRIPTOFANO OSSIDASI b-IDROSSIACIDO DEIDROGENASI FUMARASI

35. OSSERVAZIONI CITOLOGICHE CROMOSOMI POLITENICI • MORFOLOGIA DEL CROMOSOMA X NEI MASCHI • INCORPORAZIONE DI H3 URIDINA: • CONFRONTO DELL’INTENSITA’ DI MARCATURA SULL’X MASCHILE E SUGLI X FEMMINILI

36. RIASSUMENDO • NELLE FEMMINE DI D.m. ENTRAMBI GLI X SONO ATTIVI • IN MASCHI y/+NON SI OSSERVA VARIEGAZIONE • VARIANTI ELETTROFORETICE DELL’ENZIMA 6-PGD • TRASLOCAZIONI X;A • NEI MASCHI DI D.m. I GENI LOCALIZZATI SULL’X SONO IPER-ESPRESSI • ANALISI CITOLOGICA DI CROMOSOMI POLITENICI • INCORPORAZIONE DI H3 URIDINA • QUANTIFICAZIONE DI TRASCRITTI

37. COMPENSAZIONE DI DOSE E DETERMINAZIONE DEL SESSO GENOTIPO FENOTIPO LIVELLI SESSUALE ENZIMATICI 2X:2A F 2 1X:2A M 2 3X:3A F 2 2X:3A intersessi >3 1X:3A metamaschi >2 3X:2A metafemmine 3

38. MECCANISMO LOGICA SPERIMENTALE • DISSEZIONE GENETICA • ISOLAMENTO SI MUTANTI LETALI SESSO SPECIFICI • IDENTIFICAZIONE DELLA REGIONE CROMOSOMICA • ISOLAMENTO DEL GENE • SEQUENZIAMENTO • DEDUZIONE DELLA SEQUENZA PROTEICA • PROTEINA TRASCRITTA IN VITRO • ISOLAMENTO PRODOTTO GENICO • IDENTIFICAZIONE DELLA FUNZIONE

39. MUTANTI SxlLETALE FEMMINA SPECIFICO LEGATO ALL’X, NON ESPRESSO NEI MASCHI Da DAUGHTERLESS ALLELI COSTITUTIVI Sxl SOPPRIMOMO Da msl-1 msl-2 msl-3 AUTOSOMICI LETALI MASCHIO SPECIFICI

40. MODELLO LOCUS SULL’X LOCUS AUTOSOMICO ? XX AA Da XY AA ON Sxl OFF Mle OFF Msl1 OFF Msl2 OFF Msl3 OFF Mle ON Msl1 ON Msl2 ON Msl3 ON ACETILAZIONE ISTONI H3 E H4 DELL’X MASCHILE AUMENTO DEI LIVELLI DI ESPRESSIONE GENICA

41. ACETILAZIONE

42. In D.m l’unico X nei maschi è trascritto il doppio rispetto a ciascun X delle femmine. Nel verme gli ermafroditi dimezzano la trascrizione dei due cromosomi X per ottenere lo stesso dosaggio dei maschi X0. Nei mammiferi uno dei due cromosomi X delle femmine è trascrizionalmente inerte.