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Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静. ◆ 实验目的 ● 掌握细胞总蛋白提取技术 ● 掌握 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ● 掌握 ECL 试剂的使用、 X- 片曝光及显影方法. 实验原理 ● 将获得的蛋白质样品通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], 对不同分子量的蛋白质进行分离 ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固
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Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静
◆实验目的 ●掌握细胞总蛋白提取技术 ● 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ● 掌握ECL试剂的使用、X-片曝光及显影方法
实验原理 ●将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], 对不同分子量的蛋白质进行分离 ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固 相支持物上(PVDF膜 硝酸纤维素膜或尼龙膜上) ●用抗靶蛋白的非标记抗体(一抗)与转印膜 进行反应,使其与膜上的靶蛋白发生特异性结 合.
●结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗 进行结合; ● 经ECL发光试剂作用、X-光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。
ECL 试剂 + + 一抗 一抗 二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG) 一抗(兔抗Actin) 曝光后的蛋白条带 X光片曝光显影 含有转印蛋白的PVDF膜 ECL 转印膜上蛋白检测示意图
◆ 实验分为三个部分 ●细胞总蛋白质的提取及含量测定; ●SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ●凝胶转膜及其检测
♣实验流程 提取细胞总蛋白、测定含量 ↓ 制备SDS-PAGE胶 ↓ 蛋白样品变性、电泳 ↓ 凝胶转膜 ↓ 封闭(室温1小时) ↓ 一抗反应(4℃过夜) ↓ 二抗反应 (室温、避光50分钟) ↓ ECL试剂作用 ↓ X-光片曝光、显影 ↓ 结果分析
第一部分 细胞总蛋白的提取及含量测定
◆细胞总蛋白裂解液 1 X PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1x PBS缓冲液至 100ml PMSF储存液(100mmol/L) ★ PMSF储存液为17.4mg/ml异丙醇 -20℃保存.
☻提取细胞总蛋白 选取于60mm细胞培养皿中培养的 Hela 细胞(细胞数约为5 X 106/培养皿) ↓ 吸弃细胞培养液,用4℃预冷的1X PBS 洗细胞表面3~4次(-80℃冻存,至少可保存两周) ↓ ( 由-80℃取出冻存细胞)每培养皿加入100ul 蛋白裂解液,轻轻晃动,使裂解液均匀铺于细胞表面 ↓ 冰浴 40分钟,期间晃动3 ~4次 ↓ 用细胞刮子集中裂解液,收入1.5ml EP 管中, 12,000g 4℃ 离心20min ↓ 小心吸取上清液并分装 ,-80℃保存
★提取细胞总蛋白注意事项 ●FMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤,吸 入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛 或皮肤接触了PMSF,立即用大量水冲洗. ● PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定, 应在 临用前加入,使终浓度为1 mmol/L ( 10ul储 存液/ml裂解液 )
● 为防止蛋白降解, 操作全部应在冰上完成, 所用离心机需提前预冷. ● 提取的蛋白质样品应小量分装,冻存于-80℃, 切勿反复冻融已制备好的样品。
☻蛋白质含量测定 ◆ 测定意义 ●为确保蛋白质通过SDS-PAGE获得最好分离效 果,有必要对提取的蛋白质总量做粗略的估计 ●蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋 白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳 方法的分辨力
◆ 蛋白质含量测定常用方法 ● 标准Bradford分析法 ●双缩尿测定法 ●紫外光谱吸收法 ●Folin酚法
☻ 测定细胞总蛋白含量步骤 (Bradford) ◆ 制作样品蛋白标准曲线 将牛血清白蛋白(BSA)用生理盐水配制成 0.5mg/ml的标准品蛋白,4℃保存 ↓ 用PBS稀释上述标准品蛋白,使成 0、2、4、6、8 、10ug/100ul 分别编号为1、2、3、4、 5、6 ↓ 每管中分别加入1.5ml考马斯亮蓝使用液 ↓ 紫外分光光度计上测定595nm吸光度值 ↓ 依据所得读数制作标准曲线图
◆测定样品蛋白浓度 吸取适量样品蛋白加至PBS中 使总体积至100ul ↓ 向上述管中加入1.5ml考马斯亮蓝使用液 ↓ 测定595nm吸光度值 ↓ 将所得读数与标准曲线图比对, 从而推算出蛋白样品浓度
◆ 标准曲线及待测蛋白样品稀释方法 编号 加样量 生理水量 考马斯亮蓝 实际浓度 (BSA) 1 0ul100ul1500 ul 0ug/100ul 2 4ul96ul1500 ul 2 ug/100ul 3 8ul92ul1500 ul4 ug/100ul 4 12ul88ul1500 ul6 ug/100ul 5 16ul84ul1500 ul8 ug/100ul 6 20ul80ul1500 ul10ug/100ul 蛋白样品 12 ul98 ul1500 ulug/100ul 2 2 ul98 ul1500 ulug/100ul 32 ul98 ul1500 ulug/100ul 42 ul98 ul1500 ulug/100ul
BSA 浓度 OD 值2ug0.08 4ug 0.169 6ug 0.265 8ug 0.327 10ug 0.377
★测定蛋白含量注意事项 ●制作的BSA标准曲线如不规律,应重新再做 ● 如果待测样品浓度过高(如组织提取物),可用生理盐水 将其稀释10~20倍后测定;如样品浓度低,可适当增加 样品微升数或减少水的微升数. ●比色皿的清洁:考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净,因此使用后 的比色皿除用清水冲洗后,还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分 以脱色,而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。
第二部分 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
◆ 原理 ● SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质做定性 分析的常用的实验方法, 适用于蛋白质纯度检 测和分子量测定 ● SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分为只有分离胶的 连续系统和既有分离胶又有浓缩胶的不连续系统. ● 连续系统的电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度 相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子 筛效应。
● 在不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH 、凝 胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场 中泳动不仅有电荷效应, 分子筛效应,还具有把 样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力. 当样 品首先通过高度多孔性的积层胶时,样品中所含 SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的 区带(或称积层),因此其分离条带的清晰度及 分辨率均较高。
● SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联 度. 在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速 度取决于分子大小 .
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围/KDa 1510-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212
●对蛋白质样品做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析时,要在样品中加入含有SDS(十二烷 基磺酸钠)、-巯基乙醇、指示剂及甘油或 蔗糖的电泳上样液. ●SDS是一种阴离子表面活性剂,它可以断开 分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构;-巯基乙醇是强还原剂, 它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键.
● 蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度,有助于● 蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度,有助于 加样时样品溶液沉入加样孔底部; ● 样品蛋白中加入电泳上样液后,要经过高温处 理,使SDS与蛋白质充分结合,造成蛋白质完 全变性和解聚,并形成棒状结构; ●电泳上样液中通常含有溴酚蓝染料做指示剂, 用于控制电泳过程;
☻制备SDS-PAGE凝胶程序 ●制备电泳用玻璃凝胶槽 ● 确定灌制分离胶液面标志线
◆ 配制分离胶和浓缩胶 配制10%SDS-PAGE分离胶 (15ml) 5%浓缩胶(4ml) 去离子水 5.9ml 2.7 ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67ml 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml / 1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 / 0.5ml 1 0%过硫酸胺 0.15ml 0.04ml 10%SDS 0.15ml 0.04ml TEMED(临用前加入)0.008 ml 0.004ml ●取上述分离胶1ml, 加入TEMED3ul, 混匀后用其 封电泳用玻璃夹板周边至其凝固.
◆灌制分离胶 ●在分离胶液中加入 6ul TEMED,混合均匀,迅速 用巴斯德吸管轻轻加入玻璃凝胶槽中,直至液面标 志线处. ● 立即用 0.1%SDS液覆盖胶面,室温放置约40分钟 至分离胶凝固。
●轻轻倒掉0.1%SDS覆盖液,去离子水冲洗分离胶●轻轻倒掉0.1%SDS覆盖液,去离子水冲洗分离胶 表面2-3次,洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶,用吸水 纸吸掉残留的液体。 ●将凝胶板垂直放置,轻轻加入5%积层胶液,插入 样品梳,室温凝胶约40分钟。
◆ 蛋白样品变性 ● 由-80℃冰箱取出细胞总蛋白样品,立即插入冰中 ( 减少蛋白降解)待其融化 ● 吸取15ul 细胞总蛋白样品 , 加入 4×蛋白质凝胶电泳 上样液 , 将二者轻轻混合, 98℃变性8分钟, 立即插入 冰中 ● vortex数秒,短暂离心后轻轻加入凝胶孔中
◆电 泳 ●正确连接电泳连线(负极在上,正极在下)以保证电荷 由负极向正极方向流动。 ●接通电源,将电压调至100V,使样品通过浓缩胶(电压约 8v/cm); 当染料进入分离胶后,将电压调高到130V (约15v/cm )继续电泳,染料至分离胶适当位置时结束电 泳 ●尽量在4℃冰箱中进行电泳
★ 制备凝胶及电泳中注意问题 ●丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经 毒性并容易吸附于皮肤,其作用具有累积性, 故 称量时应戴手套及口罩 ● 不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大, 建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用 ● 电泳同时设立标准蛋白分子量Marker
● 过硫酸铵会缓慢分解,应隔周新鲜配制; ● 一旦加入TEMED,应立即混旋并快速灌注入玻璃夹 槽中; ● 为保持电泳的平衡,在无样品孔中也应加入适量的4x 蛋白质电泳上样缓冲液;
● 制备凝胶电泳用玻璃板的硅化处理 将二氯二甲硅烷用氯仿或庚烷配成5%溶液,用其 浸泡或擦拭玻璃板, 有机溶剂挥发时,二氯二甲硅烷 即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于 180℃烘考2小时。
第三部分 凝胶转膜及其检测 通过电转移法将SDS-PAGE胶上分离到的蛋白质转印至PVDF膜上
◆转膜步骤 ●PVDF膜预处理:剪裁与胶大小一致的PVDF膜, 将其浸入甲醇液中浸泡10sec 、去离子水中浸泡 5min、 1 X转移缓液中浸泡至少15min。 ● 剪裁与胶同样大小的6层滤纸,用转移缓冲液打湿 后待用。
●电泳结束后由电泳槽上取下电泳板,将其平置●电泳结束后由电泳槽上取下电泳板,将其平置 ( “凹”面玻璃板在下),小心取出两玻璃板之 间的垫片,掀去上层玻璃板,切除多余凝胶, 将样品胶在转膜液中漂洗一次。
●安装转膜板: 打开转膜夹板,由阳极侧开始, 依次为海绵垫片→3层 滤纸→PVDF膜→样品凝胶→三层滤纸(排除气泡) →海绵垫片
● 扣紧转膜夹板,放入含有转膜缓冲液的转移● 扣紧转膜夹板,放入含有转膜缓冲液的转移 电泳槽中。 ● 接通电源,恒压状态下,80v 转膜2h(此步 操作宜在 4℃冰箱中进行)。
★注 意 ●为避免操作中的失误, 在转移前将膜与胶做同侧 标记; ● 检查样品凝胶是否与转移槽的 “-”侧保持一致 , 以 确保样品蛋白由凝胶转移至PVDF膜 .
◆封闭转印膜 ●转移结束后, 小心取出转移膜(用铅笔轻轻瞄出蛋白 Marker带),在1XTBST液中漂洗两次 ●将转移后的膜放入5%(w/v)脱脂奶粉中,室温、摇床 上避光封闭1h( 或4℃过夜)