PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO

PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO • Potřebné látky, které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení, mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat - heterotrofie). • Stresové situace, se kterými se celistvá rostlina vypořádá, není často explantát schopen řešit a zvládnout. • Nutnost indukce organogenních změn vyžadujezabezpečení indukčních podmínek jakfyzikálních, tak chemických. TeplotaSvětloVlhkostSložení plynné fázeSložení médiíAseptická kultivaceOšetření mateřských rostlinTyp explantátu

Příprava a komponenty kultivačních médií

komponenty kultivačních médií minerální soli • makroelementy (nad 0,5mmol/l) • mikroelementy zdroj uhlíku a energie vitaminy růstové regulátory zdroje org. dusíku (aminokyseliny apod.) další organické doplňky

Makroelementy: N(25-60mM) - NH4(2-20mM)(nitrátreduktáza), - NO3(25-40mM) (ne samotnýpH) bílkoviny, aminokyseliny P(1-3mM) - H2PO3, - HPO3, (- PO3) energetický metabolismus - ATP; DNA, RNA; fosfolipidy K(20-30mM) - osmotická regulace, pH a iontová rovnováha

Makroelementy: S(1-3mM) - obranné reakce (glutathion, flavonoidy) Ca(1-3mM) - transport, signály, membrána, iontová rovnováha, zakořenění, buněčné dělení Mg(1-3mM) - enzymy, syntéza DNA, fotosyntéza

Mikroelementy: Fe (0,1 mM)- (FeNaEDTA -etylendiaminotetraoctová kys.)do pH8 přenašeče el., proteiny - nitrátreduktáza, biosyntéza chlorofylu, Zn (5-30 M) - enz. např alkohol dehydrogenáza v meristémech, účast při syntéze proteinů Mn (20-90 M)- metaloproteiny, Hillova reakce (rozklad vody při fotosyntéze) Mo (1 M)- kofaktor v nitrátreduktáze Cu (0,1 M)- redoxní reakce, fotosyntéza B (25-100 M)stabilita membrán

Zdroje C (sacharidy) 2-5% • sacharoza • glukoza • fruktoza (*termolabilní) • laktoza • maltoza (*) • škrob • inositol (do 0,5%) • (polyetylenglykol, manitol, sorbitol apod.)

Vitamíny (*) • hlavně skupiny B (0,1-10mg/l) (kvasniční extrakt): B1(thiamin), k. nikotinová, B6 pyridoxin • k. pantothenová • biotin, cholin chlorid • k. listová, k. p-aminobenzoová • riboflavin • k. askorbová jako antioxidant • (myo-inositol (50-5000mg/l))

Růstové regulátory auxiny - • IAA * • NAA(2x), IBA(2x), 2,4-D (8-12x), Picloram (2-4x)(4-amino,3,5,6-trichloropikolinová kys.) (2,4,5-T(4x), pCPA)

Působení auxinů in vitro • indukce kalusu a jeho růst • podporuje dělení buněk • konc (v poměru k CK)  kořeny • konc (v poměru k CK)  prýty • konc - indukce somatické embryogeneze • inhibice axilár (apikální dominance) • indukce kořenů x inhibice prodl. růstu kořenů

cytokininy • 2iP *, zeatin* • BAP(6-benzylaminopurin) (*) • kinetin(furfurylaminopurin) * • adenin * • TDZ thidiazuron *

Působení cytokininů in vitro • konc prýty • dělení buněk • (SE indukce somatické embryogeneze) • indukce kalusu a jeho růst • stimulace růstu axilárních pupenů • inhibice tvorby kořenů • inhibice prodlužování prýtů • oddálení stárnutí listů •  konc - riziko hyperhydricity (vitrifikace)

Vitrifikace hyperhydricita • Příčiny vitrifikace • vysoká relativní vlhkost •  etylén •  cytokininy • ?? NH4+ Fyziologický stav: Nutnost snížit R.H., zvýšit výměnu vzduchu, snížit obsah cytokininů

Vitrifikace hyperhydricita Fyziologický stav: • ztluštělé stonky i listy, světle zelené, křehké s abnormálním sklovitým vzhledem • nadměrný příjem vody • narušené stomatální uzavírání • změny ve složení epikutikulárních vosků • defektní kutikula • redukovaná vodivá pletiva • velké mezibuněčné prostory v houbovém parenchymu • disbalance mezi buněčným dělením a diferenciací (lignin, celulóza) • změny ve stavbě buněčných stěn • velké vakuoly

gibereliny GA3 GA7 * Působení in vitro • prodlužování prýtů • vymanění z dormance: semen, SE, apikálních pupenů, hlíz • inhibice tvorby adventivních kořenů

k. abscisová ABA* působení in vitro • maturace SE • usnadnění aklimatizace • formování hlíz a cibulí • vstup do dormance

Další látky s růstově regulační povahou Polyaminy(spermin, spermidin a putrescin)* • indukce adventivních kořenů • indukce prýtů • podpora SE Jasmonová kyselina * • podpora tvorby hlíz • podpoření formování meristému Fenolické látky- k. salicylová (obranné reakce), trans-skořicová (antiauxin) apod.

Organické dusíkaté látky - • L- aminokyseliny - glycin (2mg/l), glutamin (*) (150-400), asparagin (100), cystein (10) • peptidy (*) nebo jejich ne přesně definované směsi: pepton, trypton kazein hydrolyzát (0,2-1g/l)

Nedefinované doplňky media • kvasniční (yeast) a sladový (malt) extrakt, • kokosové mléko, pomeranč., rajč. a mrkvový džus, banánový homogenát, březová míza • huminové sloučeniny

Moderátory pH pufry Moderátory oxidace, produkce a kumulace fenolických látek aktivní uhlí (0,1 - 0,5%)pohlcuje i část RR! PVP - polyvinil pyrolidon (250-1000 mg/l) k. askorbová a citronová (po 100 mg/l)L-cystein (10 mg/l) thiourea, dithiothreitol

Další doplňky media • Antibiotika* (penicilin, ampicilin, bacitracin, gramicidin, neomycin, nystatin, cefotaxim, ticarcilin, timentin, kanamycin aj.) • Prekurzorya elicitory (produkce sekundárních metabolitů) • Odpěňovací prostředky (bioreaktory)

Ztužovací látky Agar (0,6-1%) - polymer galaktózy (agarózy) - z buněčných stěn řas (Sphaerococcus euchema,Gelidium a Gracilaria) • teplota (snese opakované roztavení) • pH (optimum 5,5-5,8) pH<4  neztuhne • čistota

Ztužovací látky Gelrit (0,2-0,35%) glukóza, glukuronová kyselina a rhamnóza - tetrasacharid gel jen za přítomnosti iontů Ca2+ a Mg2+ pH 4 4.92g/L pH 5 2.93g/L pH 6 1.36g/L pH 7 0.64g/L pH 8 0.50g/L pH 9 0.40g/L • čirý • nesnese opakované zahřátí!

Ztužovací látky • Phytagel (Mg, Ca) • biogel P200 (polyacrylamidová blanka) • agargel (směs agaru a synt. gelu) • alginát (protoplastové kultury) • agaróza • rozpustný škrob

Osmotikamanitol, inositolPEG 4000 - polyetylene glycol

pH • Po autoklavování pokles o cca 0,3-0,5 (pH 4,5 a 7 hranice; pH 5-6 optimum)

PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO