בקרת ה- pH על פעילות החלבון הממברנלי המשחלף NhaA

1. בקרת ה-pH על פעילות החלבון הממברנלי המשחלף NhaA שירה אגסי אביבית אוליאל עמית מאיר

2. מוטציה בחלק חוצה הממברנה החלפת החומצה האמינית Glycine338 ב-Serine

3. quenching dequenching ניסוי 1: השוואה בין פעילות החלבון הWT לבין המוטנט NhaA – G338S – AXH ב-pH שונים • ממברנות הפוכות של E.coli – בעלות חלבון WT וחלבון מוטנטי. • מדידת הפעילות באמצעות קריאת פלורסנציה (אקריל-אוראנג'). • חישוב % הפעילות של הממברנות ב-w.t. לעומת המוטנט

4. תוצאות ניסוי 1 • הבדל משמעותי בפעילות ה-w.t. מול המוטנט. • יצירת המוטציה מבטלת את רגישות האנטיפורטר לגראדינט הפרוטונים, וגורמת להפעלה קונסטיטוטיבית גם ברמות pH נמוכות – כלומר גם בריכוזי H+ גבוהים יחסית.

5. ניסוי 2 - גילוי שינוי קונפורמציה באמצעות חיתוך בטריפסין • שאלה בעקבות ניסוי 1: מדוע החלפה של G ב- S באיזור טרנס ממברנלי יצרה שינוי בבקרת הפעילות ע"י pH? • השערה: • Glycine יוצרת קשרים הידרופוביים, בעוד ש-Serine הידרופילית ויוצרת קשרי מימן. • המוטציה משרה שינוי קונפורמציה ומפריעה לוויסות ה-pH שמתקבל עקב אינטרקציות בין לופ VI ללופ XI.

6. תיאור הניסוי • חיתוך בטריפסין (חלבון החותך בקצה ה-C' של Serine) של החלבונים (מוטנט ו-w.t.) ב-pH שונים. • הרצה בג'ל

7. תוצאות ניסוי 2 w.t. Mutant G338S סמן גודל חלבון נקי 6.5 7 8 8.5 6.5 7 8 8.5 ?

8. מסקנות ניסוי 2 • השריית מוטציה ב-G338 יוצרת שינוי קונפורמטיבי, המבטלת את רגישותו לגראדינט הפרוטונים מחוץ לתא ובתוך התא. • החלפה של G ב-S יוצרת קומפלקס פתוח שיש בו חשיפה גדולה יותר של אתרי חיתוך אפשריים לטריפסין.