Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další

1. Modely patologických stavů na zvířatech  Karin Vargová, Erika Kužmová, Tomáš Stopka, a další blokový seminář upozornění: tato prezentace (verze PPT, PDF, či jiná) není oficiální studijní materiál

2. Obsah přednášky • zvířecí modely a jejích využití • modelové organizmy • myší modely onemocnění - přirozené - indukované - transgenní modely

3. Využití zvířat jako modelů • první písemní zmínky – Řecko 2st. (pitvy, vivisekce, experimentování) • mnohé naše znalosti anatomie a fyziologie • do 70-tych let experimenty také na lidech (vojáci, vězni, mentalně zaostalí) • etické hledisko • snahy minimalizovat (3Rs - Refine, Reduce, Replace) • buněčné kultury a linie, matematické modelování, ... „In vivo veritas“

4. Zvířecí modely v biomedicíně • základní výzkum mechanizmů onemocnění • vývoj nových terapeutických strategií • vývoj a objev léčiv • předklinické studie • testováni toxicity • vývoj nových zvířecích modelů dle potřeby a zájmu

5. Výběr vhodného modelu • vhodný na sledování zvoleného onemocnění • reaguje podobně jako člověk (založené na základě evidence, nebo biologické similarity, čím základnejší biologický proces tým vyšší předpoklad, že člověk a zvíře budou reagovat podobně) • správný design experimentu (demonstrace odpovědi, vhodná velikost, délka života, adekvátní kontroly, dostatečné množství zvířat - statistické vyhodnocení) • mnohé modely jsou vysoko specifické • validace modelu (např. nové léčivo v klinické studii)

6. Požadavky na ideální modelový organizmus a) biologické • dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách • dostatečně rychlý vývoj • nekomplikovaný životní cyklus • produkce většího množství potomků b) metodické • možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a cílená mutageneze, reverzní genetika) • velikost, životnost • dostupnost sekvenčních dat • možnost transgeneze

7. Vybrané modelové organizmy Bezobratlí: háďátko(Caenorhabditis elegans) octomilka(Drosophila melanogaster) Obratlovci: drápatka (Xenopus laevis) danio(Danio rerio) zebrafish kur (Gallus gallus domesticus) myš(Mus musculus) potkan (Ratus norvegicus) králík (Oryctolagus cuniculus) ... psy, kočky, prasata, primáti - opice

8. háďátko(Caenorhabditis elegans) • především vývojová biologie • přesně definovaný počet buněk a jejich osud, průhledné • model studia nikotinové závislosti • studium molekulární genetiky stárnutí • octomilka(Drosophila melanogaster) • především genetické studie • množství mutantů a genetických modifikací • studováni genetiky poruch srdce a neurodegenerativních onemocnění • alternativa k savcům, zrychlení studia a testování terapie

9. drápatka (Xenopus laevis) • především vývojová biologie, toxikologie • studium lidských genů • (např. genů mutovaných u cystického onemocnění ledvin, • genetické nestabilitě ATM, BRCA1, nebo c-Myc u FANC, ...) • danio (Daniorerio) • využití: vývojová biologie, onkologie, • toxikologie, teratologie, výzkum • kmenových buněk, regenerativní medicína, ... • regenerace ploutev, kůže, srdce a v larválním stadiu mozku • - procesem rediferenciace, demetylace histonů – aktivní • stav buněk

10. kur (Gallus gallus domesticus) -embryo • molekulární analýza nádorů, karcinogeneze, • angiogeneze, metastáz a virové onkogeneze, • přirozená imunodeficience - xenoimplantace nádorů, • transplantační experimenty králik (Oryctolagus cuniculus) • výhoda velikost, bioreaktory, operační techniky • model aterosklerózy, spontánní mutace lipidového metabolismu, srdečná hypertrofie • geneticky podmíněný glaukom

11. potkan (Ratus norvegicus) • větší než myš (více buněk, větší orgány, ...) • neurologický model, model hypertenze • Spontánně hypertenzní krysy (SHR) • model esenciální (primární) hypertenze • rozvoj hypertenze ve věku 5–6 týdnů • ve věku 40 - 50 týdnů vaskulární komplikace a hypertrofie srdce • hypertenze, insulinová rezistence, insulinémie, hypercholesterolémie, hyperlipidémie

12. Myší modely pro studium lidských nemocí

13. myš (Mus musculus) • březost cca 20 dní • v jednom vrhu v průměru 8 mláďat • samice může mít několik vrhů do roka • samice pohlavně dozrávají cca po 6 týdnech, samci po 8 • dožívají se 2-3 roky • genom ca 2,6x109, 20 chromozomů v haploidní sadě • nevýhoda finanční náročnost • jeden lidský rok = cca 14 myších dní

14. Myší modely onemocnění • Přirozené mutace SCID (severe combined immunodeficiency NOD (non-obese DM-1) ob/ob (ob = obézní, přirozená mutace leptinu) • Indukované onemocnění fyzikálně (chirurgicky narušené) - srdečný selháni – cirkulační zkratky - jaterní selháni – biliární obstrukce chemicky - autoimunitní onemocnění – imunizace autoantigenem - chemicky indukované záněty přenosem buněk (implantace nádorových buněk) • Transgenní modely (knock-out, knock-in, např. p53)

15. Metodické přístupy • zajímá nás určité onemocnění/proces a chceme vědět, které geny ho řídí - postup od fenotypu ke genotypu • - mutageneze, výběr organizmů s určitým defektem, zpětné hledání genu • zodpovědného za daný fenotyp (genetické mapování/sekvenace) • zajímá nás určitý gen a chceme vědět, jakou úlohu hraje ve vývoji onemocnění - postup od genotypu k fenotypu • - v které části těla/buňkách a kdy je daný gen aktivní? • - co se stane, když daný gen poškodíme/odstraníme? • - co se stane, když daný gen zapneme jindy než je fyziologické?

16. Modely vzniklé přirozenou mutací(od fenotypu ke genotypu)

17. Přirozené mutace vedoucí k autoimunitním onemocněním Systémové poškození: NZBxNZW: multiorgánové autoimunitní onemocnění BXSB: Y vázané autoimunitní onemocnění MRL lpr/lpr (lympho-proliferation): mutace Fas genu MRL gld/gld (generalized lymphoproliferative disease): mutace genu Fas-L Orgánové poškození: NOD (non-obese diabetic): DM I. typu C3H/HeJ Bir: colitis

18. NOD(non-obese diabetic) myši • Model diabetu mellitu I. typu (IDDM) - samovolně se u nich rozvíjí autoimunní diabetes - incidence závisí na environmentálních faktorech - Insulitisv 5. týdnu, Diabetesv 16-30.týdnu - postihuje častěji samice (20-100%) než samce (1-65%) • Další poruchy: - porucha funkce regulačních T lymfocytů (CD4+CD25+) - nedostatek a porucha funkce NK buněk - porucha funkce komplementu (chybí C5) - porucha diferenciace a funkce antigen prezentujících buněk

19. NODmyši - podobnost s lidským DM typu 1 • protilátky proti pankreatickým antigenům • autoreaktivní CD4+ a CD8+ T lymfocyty • dědičnost je polygenní • >20 lokusů (Idd) na 11 různych chromozomech je asociováno s onemocněním Idd1 lokus, Ch17: nezbytný ale ne postačující pro vznik symptomatického DM u NOD myší • je zde kódován MHC II protein

20. Indukované modely onemocnění

21. Imunizace susceptibilních kmenů „autoantigenem“ • Experimentální autoimunitní encephalomyelitis (EAE) • Myelin basic protein (MBP) • Proteolypid protein (PLP) • Myelin oligodendrocyte protein (MOG) • Experimentální myastenia gravis (EMG) • Torpedo AChR • Experimentální arthritis • Kolagen typ II • HSP • Experimentální uveoretinitis • S-antigen • IRBP

22. Experimentální asthma bronchiale imunizace dendritickými buňkami s ovalbuminem (OVA-DC) později inhalace OVA aerosolu Zdravá plíce Plíce po imunizaci a inhalaci OVA perivaskulární a peribronchiální eozinofilní infiltráty „pohárkové buňky“ hyperplazie Lambrecht B.N., J Clin Invest, vol. 106, pp. 551-559

23. Experimentální insulitis u Balb/c myšíimunizace s částí inzulínu peptid (9-23) a poly-IC (adjuvant) Tetanus toxoid plus PolyIC bez patol. nál. , bez zánětu a B:9–23 imunizace pankreas bez patol. nál. , bez zánětu b B:9–23 plus PolyIC zánět, Langerh. ostr. poškozené d B:9–23 plus PolyIC zánět, Langerh. ostr. poškozené c PNAS 99:5539-5544

24. Indukce onemocnění přenosem buněkImunodeficientní kmeny - model kancerogeneze

25. Nu/Nu myši – 1962 • gen identifikován 1994 – spontánní delece Foxn1 • Defektní vývoj thymu vede k defektu: • produkce protilátek • buňkami-zprostředkovaná imunitníodpověď • hypersezitivitapozdního typu • zničení virem infikovanýchnebo maligních buněk • odmítnutí transplantátu/štěpu • Model je používán při studiu solidních tumorů • před objevením holých myší byly lidské nádory inkubovány v imunologicky privilegovaných oblastech (přední komora oka, mozek, lícní kapsa)

26. SCID (Prkdc/Scid) myši • 1983 (Blunt et al., PNAS 1996) • homozygotní mutace genu pro Protein kinase DNA-activated catalytic polypeptid • DNA-dependentní protein kináza • aktivovaná zlomy v dvoušroubovici DNA • nezbytná pro vytvoření místa pro vazbu antigenu na molekule imunoglobulinu a receptoru T-buněk • defekt při rekombinaci V(D)J fragmentů • blok v diferenciaciT a B lymfocytů • Nízká schopnost opravovat zlomy v DNA • zvýšené riziko vzniku rakoviny (lymfom)

27. SCID myši • Podobné projevy jako lidský SCID • >50% lidských SCIDsje X-vázaných • mutace ADA, IL2R společného γ-řetězce • Studium maligních nádorů • implantace lidských nádorových buněk • Hostitel tkáně lidského imunitního systému- studie HIV • Nevýhody • „Leaky phenotype“ (děravý fenotyp) – hladiny imunoglobulinů se zvyšují s věkem • krátká doba života (~ 6 měsíců)

28. Transplantace/xenotransplantacebuněk • Transplantace imunokompetentních buněk (syngenní imunodeficientní příjemci) multiorgánové chronické zánětlivé onemocnění • Transplantace syngenních nádorových buněk • Xenotransplantace lidských nádorových buněk (NOD/SCID-IL2Rgamma null = NOG)

29. Transgenní modely (od genotypu k fenotypu)

30. Transgenní zvířata • 1974 Rudolf Jaenisch (první transgenní zvíře) • technika rekombinantní DNA (ne přirozeně) • využití – sledováni funkce GOI (gene of interest) v tkáních/onemocněních - knock-out modely (KO) - modely s overexpresí sledované alely - knock-in modely (KI) - KO modely regulačních nebo jinak důležitých genů vůči GOI - kříženci s jinými myšími modely (vzrůstá jejich komplexita)

31. Tvorba transgeního zvířete B) • mikroinjekce DNA do pronukleu zygoty (obyčejně samčí) – vznik transgení myši • injekce ES buněk do blastocyst vnik chimérických myší • zavedení embryi do pseudopregnantních samic • vzniknou chimérické myši s mutací nebo delecí heterozygotní myši (+/-) (+/Δ) s mutací nebo delecí homozygotní myši (-/-) (Δ/Δ) s mutací nebo delecí

32. Vytvoření kondicionálního knock-outu Příprava konstruktu (in vitro) Elektroporace ES buněk (např. z kmene 129S2– donor strain – „agouti“ - hnědé) Homologní rekombinace v ES buňkách Selekce ES buněk - pozitivní (NEO) neomycin, geneticin - negativní (HSV1-TK1) ganciklovir – nespravně inkorporován plasmid Ověřeni PCR/Southern blotem Odstranění NEO kazety Heterozygotní embryonální buňky injikované do blastocyst (např. kmene C57BL/6J (background strain – “blacky”) Genotypování mláďat - DNA z chvostu a opět ověření PCR/Southern blotem pomocí prob k specifickým fragmentům Křížení s Cre rekombinantním jedincem a vytvoření knocout alely

33. Myší modely Li-Fraumeny syndromu

34. Li–Fraumeni syndrom (LFS) • vzácná autozomálně dominantní vrozená predispozice k rakovině asociovaná s mutací genu TP53 • SBLAsyndrom (sarcoma, breast, leukemia, adrenal glad); také nádory mozku - glioblastomy, plic, kostní sarkomy a lymfomy • spektrum mutací TP53je podobné somatickým mutacím u sporadických nádorů • risk vzniku rakoviny (kromě rakoviny kůže) je 50% do 30 let a 90% do 70 let, celkově 100%u žen a 73% u mužů

35. p53 • transkripční faktor „strážce genomu“ • tumor supresorový protein • mutace - nejčastěji pozorovaná genetická anomálie v lidských rakovinotvorných buňkách • reguluje buněčnou odpověd na cytogenotoxický stres a DNA poškození (UV a ionizující záření, hypoxi, nutriční stres, ...) • indukuje opravu DNA poškození, zástavu buněčného cyklu v G1/S/G2 fázy, inhibici angiogenezy a tvorby metastáz, apoptózu a buněčnou senescenci DNA binding domain sekvence kodonů struktura proteinu p53 a frekvence mutaci ve vztahu k funkčním doménam proteinu v lidských nádorech

36. Myší modely ve vztahu k p53 I. • první model overexprese p53 (A135V) Lavigeur et al. 1989 • modely deficientní na p53 Donehower et al. 1992, Jacks et al. 1994 • - oba modely - zvýšená náchylnost ke vzniku nádorů • - p53 není nezbytné pro normální vývoj organizmu Donehower & Lozano 2009 Cancer

37. Myší modely ve vztahu k p53 II. mouse p53m mouse p53 A135V p53 super Swap p53

38. náš p53 model Nomenklatura: B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J 129S2 – donor strain – “agouti”; C57BL/6J(background strain – “blacky”) transformation related protein 53; targeted mutation 1 The Jackson Laboratory; Tyj Dr. Tyler Jackset al. 1994 Current Biology p53-/- Křivky vzniku nádorů a přežívání p53-/- p53+/- a wt Distribuce nádorů u p53+/- ap53-/- mutantů Jacks et al. 1994 Current Biology

39. Podobnost myších modelů s LFS • - u 20% LFS je nefunkční alela p53 – KO mutace • zbytek hot-spot mutaceR175H and R273H (u myší R172H and R270H) • avšak nádory mléčné žlázy se u těchto mutantů vyskytují s nízkou frekvencí • vliv genetického pozadí • C57BL/6 vs. Balb/c • Balb/c p53+/– – u 55% samic nádory mléčnéžlázy, více “LFS-like”

40. Význam biologických modelů v patofyziologii nemocí • objasnění vlivu genů a epigenetických faktorů v patogenezi choroby • identifikace genů zodpovědných za modifikaci klinických příznaků choroby • potvrzení/vyvrácení vlivu faktorů okolního prostředí na vznik choroby • objasnění regulačních mechanismů • testování nových léčebných postupů • zavedení nových diagnostických postupů

41. Linky na instituce poskytujíci zvířecí modely Charles River laboratories http://www.criver.com The Jackson laboratory http://www.jax.org/ U nás: Anlab, Velaz http://www.anlab.cz; http://www.velaz.cz/

42. Děkuji za pozornost jmeno.prijmeni@lf1.cuni.cz