1 / 42

Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další

Modely patologických stavů na zvířatech . Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další. blokový seminář. u pozorn ění: t a to prezentace (verze PPT, PDF, či jiná ) není oficiální studijní materi á l. Obsah přednášky. zvířecí modely a jejích využití modelové organizmy

eara
Download Presentation

Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Modely patologických stavů na zvířatech  Karin Vargová, Erika Kužmová, Tomáš Stopka, a další blokový seminář upozornění: tato prezentace (verze PPT, PDF, či jiná) není oficiální studijní materiál

  2. Obsah přednášky • zvířecí modely a jejích využití • modelové organizmy • myší modely onemocnění - přirozené - indukované - transgenní modely

  3. Využití zvířat jako modelů • první písemní zmínky – Řecko 2st. (pitvy, vivisekce, experimentování) • mnohé naše znalosti anatomie a fyziologie • do 70-tych let experimenty také na lidech (vojáci, vězni, mentalně zaostalí) • etické hledisko • snahy minimalizovat (3Rs - Refine, Reduce, Replace) • buněčné kultury a linie, matematické modelování, ... „In vivo veritas“

  4. Zvířecí modely v biomedicíně • základní výzkum mechanizmů onemocnění • vývoj nových terapeutických strategií • vývoj a objev léčiv • předklinické studie • testováni toxicity • vývoj nových zvířecích modelů dle potřeby a zájmu

  5. Výběr vhodného modelu • vhodný na sledování zvoleného onemocnění • reaguje podobně jako člověk (založené na základě evidence, nebo biologické similarity, čím základnejší biologický proces tým vyšší předpoklad, že člověk a zvíře budou reagovat podobně) • správný design experimentu (demonstrace odpovědi, vhodná velikost, délka života, adekvátní kontroly, dostatečné množství zvířat - statistické vyhodnocení) • mnohé modely jsou vysoko specifické • validace modelu (např. nové léčivo v klinické studii)

  6. Požadavky na ideální modelový organizmus a) biologické • dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách • dostatečně rychlý vývoj • nekomplikovaný životní cyklus • produkce většího množství potomků b) metodické • možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a cílená mutageneze, reverzní genetika) • velikost, životnost • dostupnost sekvenčních dat • možnost transgeneze

  7. Vybrané modelové organizmy Bezobratlí: háďátko(Caenorhabditis elegans) octomilka(Drosophila melanogaster) Obratlovci: drápatka (Xenopus laevis) danio(Danio rerio) zebrafish kur (Gallus gallus domesticus) myš(Mus musculus) potkan (Ratus norvegicus) králík (Oryctolagus cuniculus) ... psy, kočky, prasata, primáti - opice

  8. háďátko(Caenorhabditis elegans) • především vývojová biologie • přesně definovaný počet buněk a jejich osud, průhledné • model studia nikotinové závislosti • studium molekulární genetiky stárnutí • octomilka(Drosophila melanogaster) • především genetické studie • množství mutantů a genetických modifikací • studováni genetiky poruch srdce a neurodegenerativních onemocnění • alternativa k savcům, zrychlení studia a testování terapie

  9. drápatka (Xenopus laevis) • především vývojová biologie, toxikologie • studium lidských genů • (např. genů mutovaných u cystického onemocnění ledvin, • genetické nestabilitě ATM, BRCA1, nebo c-Myc u FANC, ...) • danio (Daniorerio) • využití: vývojová biologie, onkologie, • toxikologie, teratologie, výzkum • kmenových buněk, regenerativní medicína, ... • regenerace ploutev, kůže, srdce a v larválním stadiu mozku • - procesem rediferenciace, demetylace histonů – aktivní • stav buněk

  10. kur (Gallus gallus domesticus) -embryo • molekulární analýza nádorů, karcinogeneze, • angiogeneze, metastáz a virové onkogeneze, • přirozená imunodeficience - xenoimplantace nádorů, • transplantační experimenty králik (Oryctolagus cuniculus) • výhoda velikost, bioreaktory, operační techniky • model aterosklerózy, spontánní mutace lipidového metabolismu, srdečná hypertrofie • geneticky podmíněný glaukom

  11. potkan (Ratus norvegicus) • větší než myš (více buněk, větší orgány, ...) • neurologický model, model hypertenze • Spontánně hypertenzní krysy (SHR) • model esenciální (primární) hypertenze • rozvoj hypertenze ve věku 5–6 týdnů • ve věku 40 - 50 týdnů vaskulární komplikace a hypertrofie srdce • hypertenze, insulinová rezistence, insulinémie, hypercholesterolémie, hyperlipidémie

  12. Myší modely pro studium lidských nemocí

  13. myš (Mus musculus) • březost cca 20 dní • v jednom vrhu v průměru 8 mláďat • samice může mít několik vrhů do roka • samice pohlavně dozrávají cca po 6 týdnech, samci po 8 • dožívají se 2-3 roky • genom ca 2,6x109, 20 chromozomů v haploidní sadě • nevýhoda finanční náročnost • jeden lidský rok = cca 14 myších dní

  14. Myší modely onemocnění • Přirozené mutace SCID (severe combined immunodeficiency NOD (non-obese DM-1) ob/ob (ob = obézní, přirozená mutace leptinu) • Indukované onemocnění fyzikálně (chirurgicky narušené) - srdečný selháni – cirkulační zkratky - jaterní selháni – biliární obstrukce chemicky - autoimunitní onemocnění – imunizace autoantigenem - chemicky indukované záněty přenosem buněk (implantace nádorových buněk) • Transgenní modely (knock-out, knock-in, např. p53)

  15. Metodické přístupy • zajímá nás určité onemocnění/proces a chceme vědět, které geny ho řídí - postup od fenotypu ke genotypu • - mutageneze, výběr organizmů s určitým defektem, zpětné hledání genu • zodpovědného za daný fenotyp (genetické mapování/sekvenace) • zajímá nás určitý gen a chceme vědět, jakou úlohu hraje ve vývoji onemocnění - postup od genotypu k fenotypu • - v které části těla/buňkách a kdy je daný gen aktivní? • - co se stane, když daný gen poškodíme/odstraníme? • - co se stane, když daný gen zapneme jindy než je fyziologické?

  16. Modely vzniklé přirozenou mutací(od fenotypu ke genotypu)

  17. Přirozené mutace vedoucí k autoimunitním onemocněním Systémové poškození: NZBxNZW: multiorgánové autoimunitní onemocnění BXSB: Y vázané autoimunitní onemocnění MRL lpr/lpr (lympho-proliferation): mutace Fas genu MRL gld/gld (generalized lymphoproliferative disease): mutace genu Fas-L Orgánové poškození: NOD (non-obese diabetic): DM I. typu C3H/HeJ Bir: colitis

  18. NOD(non-obese diabetic) myši • Model diabetu mellitu I. typu (IDDM) - samovolně se u nich rozvíjí autoimunní diabetes - incidence závisí na environmentálních faktorech - Insulitisv 5. týdnu, Diabetesv 16-30.týdnu - postihuje častěji samice (20-100%) než samce (1-65%) • Další poruchy: - porucha funkce regulačních T lymfocytů (CD4+CD25+) - nedostatek a porucha funkce NK buněk - porucha funkce komplementu (chybí C5) - porucha diferenciace a funkce antigen prezentujících buněk

  19. NODmyši - podobnost s lidským DM typu 1 • protilátky proti pankreatickým antigenům • autoreaktivní CD4+ a CD8+ T lymfocyty • dědičnost je polygenní • >20 lokusů (Idd) na 11 různych chromozomech je asociováno s onemocněním Idd1 lokus, Ch17: nezbytný ale ne postačující pro vznik symptomatického DM u NOD myší • je zde kódován MHC II protein

  20. Indukované modely onemocnění

  21. Imunizace susceptibilních kmenů „autoantigenem“ • Experimentální autoimunitní encephalomyelitis (EAE) • Myelin basic protein (MBP) • Proteolypid protein (PLP) • Myelin oligodendrocyte protein (MOG) • Experimentální myastenia gravis (EMG) • Torpedo AChR • Experimentální arthritis • Kolagen typ II • HSP • Experimentální uveoretinitis • S-antigen • IRBP

  22. Experimentální asthma bronchiale imunizace dendritickými buňkami s ovalbuminem (OVA-DC) později inhalace OVA aerosolu Zdravá plíce Plíce po imunizaci a inhalaci OVA perivaskulární a peribronchiální eozinofilní infiltráty „pohárkové buňky“ hyperplazie Lambrecht B.N., J Clin Invest, vol. 106, pp. 551-559

  23. Experimentální insulitis u Balb/c myšíimunizace s částí inzulínu peptid (9-23) a poly-IC (adjuvant) Tetanus toxoid plus PolyIC bez patol. nál. , bez zánětu a B:9–23 imunizace pankreas bez patol. nál. , bez zánětu b B:9–23 plus PolyIC zánět, Langerh. ostr. poškozené d B:9–23 plus PolyIC zánět, Langerh. ostr. poškozené c PNAS 99:5539-5544

  24. Indukce onemocnění přenosem buněkImunodeficientní kmeny - model kancerogeneze

  25. Nu/Nu myši – 1962 • gen identifikován 1994 – spontánní delece Foxn1 • Defektní vývoj thymu vede k defektu: • produkce protilátek • buňkami-zprostředkovaná imunitníodpověď • hypersezitivitapozdního typu • zničení virem infikovanýchnebo maligních buněk • odmítnutí transplantátu/štěpu • Model je používán při studiu solidních tumorů • před objevením holých myší byly lidské nádory inkubovány v imunologicky privilegovaných oblastech (přední komora oka, mozek, lícní kapsa)

  26. SCID (Prkdc/Scid) myši • 1983 (Blunt et al., PNAS 1996) • homozygotní mutace genu pro Protein kinase DNA-activated catalytic polypeptid • DNA-dependentní protein kináza • aktivovaná zlomy v dvoušroubovici DNA • nezbytná pro vytvoření místa pro vazbu antigenu na molekule imunoglobulinu a receptoru T-buněk • defekt při rekombinaci V(D)J fragmentů • blok v diferenciaciT a B lymfocytů • Nízká schopnost opravovat zlomy v DNA • zvýšené riziko vzniku rakoviny (lymfom)

  27. SCID myši • Podobné projevy jako lidský SCID • >50% lidských SCIDsje X-vázaných • mutace ADA, IL2R společného γ-řetězce • Studium maligních nádorů • implantace lidských nádorových buněk • Hostitel tkáně lidského imunitního systému- studie HIV • Nevýhody • „Leaky phenotype“ (děravý fenotyp) – hladiny imunoglobulinů se zvyšují s věkem • krátká doba života (~ 6 měsíců)

  28. Transplantace/xenotransplantacebuněk • Transplantace imunokompetentních buněk (syngenní imunodeficientní příjemci) multiorgánové chronické zánětlivé onemocnění • Transplantace syngenních nádorových buněk • Xenotransplantace lidských nádorových buněk (NOD/SCID-IL2Rgamma null = NOG)

  29. Transgenní modely (od genotypu k fenotypu)

  30. Transgenní zvířata • 1974 Rudolf Jaenisch (první transgenní zvíře) • technika rekombinantní DNA (ne přirozeně) • využití – sledováni funkce GOI (gene of interest) v tkáních/onemocněních - knock-out modely (KO) - modely s overexpresí sledované alely - knock-in modely (KI) - KO modely regulačních nebo jinak důležitých genů vůči GOI - kříženci s jinými myšími modely (vzrůstá jejich komplexita)

  31. Tvorba transgeního zvířete B) • mikroinjekce DNA do pronukleu zygoty (obyčejně samčí) – vznik transgení myši • injekce ES buněk do blastocyst vnik chimérických myší • zavedení embryi do pseudopregnantních samic • vzniknou chimérické myši s mutací nebo delecí heterozygotní myši (+/-) (+/Δ) s mutací nebo delecí homozygotní myši (-/-) (Δ/Δ) s mutací nebo delecí

  32. Vytvoření kondicionálního knock-outu Příprava konstruktu (in vitro) Elektroporace ES buněk (např. z kmene 129S2– donor strain – „agouti“ - hnědé) Homologní rekombinace v ES buňkách Selekce ES buněk - pozitivní (NEO) neomycin, geneticin - negativní (HSV1-TK1) ganciklovir – nespravně inkorporován plasmid Ověřeni PCR/Southern blotem Odstranění NEO kazety Heterozygotní embryonální buňky injikované do blastocyst (např. kmene C57BL/6J (background strain – “blacky”) Genotypování mláďat - DNA z chvostu a opět ověření PCR/Southern blotem pomocí prob k specifickým fragmentům Křížení s Cre rekombinantním jedincem a vytvoření knocout alely

  33. Myší modely Li-Fraumeny syndromu

  34. Li–Fraumeni syndrom (LFS) • vzácná autozomálně dominantní vrozená predispozice k rakovině asociovaná s mutací genu TP53 • SBLAsyndrom (sarcoma, breast, leukemia, adrenal glad); také nádory mozku - glioblastomy, plic, kostní sarkomy a lymfomy • spektrum mutací TP53je podobné somatickým mutacím u sporadických nádorů • risk vzniku rakoviny (kromě rakoviny kůže) je 50% do 30 let a 90% do 70 let, celkově 100%u žen a 73% u mužů

  35. p53 • transkripční faktor „strážce genomu“ • tumor supresorový protein • mutace - nejčastěji pozorovaná genetická anomálie v lidských rakovinotvorných buňkách • reguluje buněčnou odpověd na cytogenotoxický stres a DNA poškození (UV a ionizující záření, hypoxi, nutriční stres, ...) • indukuje opravu DNA poškození, zástavu buněčného cyklu v G1/S/G2 fázy, inhibici angiogenezy a tvorby metastáz, apoptózu a buněčnou senescenci DNA binding domain sekvence kodonů struktura proteinu p53 a frekvence mutaci ve vztahu k funkčním doménam proteinu v lidských nádorech

  36. Myší modely ve vztahu k p53 I. • první model overexprese p53 (A135V) Lavigeur et al. 1989 • modely deficientní na p53 Donehower et al. 1992, Jacks et al. 1994 • - oba modely - zvýšená náchylnost ke vzniku nádorů • - p53 není nezbytné pro normální vývoj organizmu Donehower & Lozano 2009 Cancer

  37. Myší modely ve vztahu k p53 II. mouse p53m mouse p53 A135V p53 super Swap p53

  38. náš p53 model Nomenklatura: B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J 129S2 – donor strain – “agouti”; C57BL/6J(background strain – “blacky”) transformation related protein 53; targeted mutation 1 The Jackson Laboratory; Tyj Dr. Tyler Jackset al. 1994 Current Biology p53-/- Křivky vzniku nádorů a přežívání p53-/- p53+/- a wt Distribuce nádorů u p53+/- ap53-/- mutantů Jacks et al. 1994 Current Biology

  39. Podobnost myších modelů s LFS • - u 20% LFS je nefunkční alela p53 – KO mutace • zbytek hot-spot mutaceR175H and R273H (u myší R172H and R270H) • avšak nádory mléčné žlázy se u těchto mutantů vyskytují s nízkou frekvencí • vliv genetického pozadí • C57BL/6 vs. Balb/c • Balb/c p53+/– – u 55% samic nádory mléčnéžlázy, více “LFS-like”

  40. Význam biologických modelů v patofyziologii nemocí • objasnění vlivu genů a epigenetických faktorů v patogenezi choroby • identifikace genů zodpovědných za modifikaci klinických příznaků choroby • potvrzení/vyvrácení vlivu faktorů okolního prostředí na vznik choroby • objasnění regulačních mechanismů • testování nových léčebných postupů • zavedení nových diagnostických postupů

  41. Linky na instituce poskytujíci zvířecí modely Charles River laboratories http://www.criver.com The Jackson laboratory http://www.jax.org/ U nás: Anlab, Velaz http://www.anlab.cz; http://www.velaz.cz/

  42. Děkuji za pozornost jmeno.prijmeni@lf1.cuni.cz

More Related